HPLC同時測定不同產地甘松中綠原酸和甘松新酮的含量

李艷忙，劉國林，喬晶，劉爽，張瑜，秦振嫻，劉勇

(北京中醫藥大學，北京 100102)

甘松為敗醬科植物甘松(Nardostachys chinensis DC.)的干燥根及根莖，具有理氣止痛，開郁醒脾等功效，多用于治療脾胃氣滯、霍亂轉筋、脘腹脹痛、牙痛、痰眩、癔病癲癇、心悸怔忡、腳氣等［1］。甘松被列為我國二級保護藏藥，用藥歷史悠久，主要分布于甘肅、青海、四川、云南西北部、西藏等地［2］。甘松中倍半萜類成分是甘松開郁醒脾的有效成分，其中，甘松新酮是甘松中特有成分，生物活性研究表明，甘松新酮具有鎮靜、抗抑郁及促進神經細胞生長等活性［3-9］;現代藥理研究表明，甘松可以治療慢性胃炎、胃潰瘍、腳氣等癥，而甘松中綠原酸具有抗菌消炎的活性［10-11］，是甘松抗菌消炎的物質基礎。為了保證甘松的藥材質量和更好的應用于臨床治療，筆者在前期研究基礎上采用HPLC法建立同時測定甘松中綠原酸和甘松新酮含量的方法，并對25個產地的甘松進行初步研究分析，以期為藥典中甘松藥材增加甘松新酮的含量測方法、甘松資源的開發利用和藥材的質量控制提供科學和全面的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

甘松藥材(25個產地的樣品，于2013年7～8月份采自四川青海等地，經北京中醫藥大學中藥學院石晉麗教授鑒定為敗醬科植物甘松);綠原酸對照品(中國生物制品藥品檢定所，供含量測定用，批號RA0426FA14);甘松新酮(自制，含量大于98%);Waters 2695高效液相色譜儀(配DAD檢測器);Sartofius—BSll0S型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司);KQ-5200E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);乙腈(色譜純，Fisher公司)，其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(250mm×4.6mm，5μm，美國Agilent公司)，流動相A為乙腈，B為0.1%磷酸水溶液。線性梯度洗脫，0～5min，A 10%;5～15min，A 10%～15%;15～22min，A 15%～30%;22～32min，A 30%～35%;32～40min，A35%～50%;40～50min，A 50%～65%;50～60min，A 65%。柱溫為25℃;檢測波長為274nm;流速為1.0mL/min。

1.2.2 對照品溶液的配制

精密稱取干燥至恒重的綠原酸對照品4.26mg，甘松新酮對照品7.24mg，用甲醇配制成濃度分別為0.1704mg/mL、0.2896mg/mL的對照品儲備液。分別精密移取綠原酸對照品儲備液9mL，甘松新酮對照品儲備液15mL，混勻，配制成濃度分別為62.6μg/mL、177.3μg/mL的混合對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的配制

稱取各產地的甘松藥材粉末(過20目篩)約2g，精密稱定，置于100mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100mL，密封后在室溫下超聲1h，提取2次，過濾后合并提取液，濃縮，最后用甲醇定容至25mL容量瓶內，取續濾液經微孔濾膜(0.45μm)過濾，即得供試品溶液。

1.2.4 線性關系考察

高效液相色譜儀分別精密進樣2，5，10，20，30，50μL混合對照品溶液，在“1.2.1”項色譜條件下測定，記錄色譜圖。以峰面積(Y)為縱坐標，進樣量為橫坐標(X)，繪制標準曲線，并進行線性回歸。

1.2.5 精密度考察

在“1.2.1”項色譜條件下連續進樣對照品溶液6次，每次10μL，記錄色譜峰面積，計算儀器精密度。

1.2.6 重復性試驗

選取四川阿壩縣河支鄉的甘松樣品為供試品，精密稱取6份樣品，按照“1.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“1.2.1”項色譜條件下進樣測定，計算綠原酸、甘松新酮的峰面積的RSD值，以評價方法的重現性。

1.2.7 穩定性試驗

取同一份甘松樣品，在室溫下放置，分別在0，2，4，8，12，24h進樣10μL測定分析，記錄色譜峰面積，計算綠原酸和甘松新酮的RSD，以評價供試品溶液的穩定性。

1.2.8 加樣回收率試驗

稱取已知含量(綠原酸、甘松新酮)的四川阿壩縣河支鄉的甘松樣品6份，每份約2g，精密稱定，分別精密加入混合對照品溶液，按“1.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“1.2.1”項色譜條件下測定，計算回收率和RSD值。

1.2.9 甘松樣品含量的測定

取不同產地的甘松藥材粉末，按“1.2.3”項下方法配制樣品溶液，在“1.2.1”項色譜條件下進樣分析，測定綠原酸和甘松新酮的峰面積，以外標法計算兩種成分在甘松樣品中的含量。

2 結果

2.1 對照品與供試品溶液的色譜分析結果

對照品及供試品溶液的色譜圖見圖1。由圖1可知，理論塔板數按綠原酸、甘松新酮和隱丹參酮計算均不低于5000，且三者分離度均大于1.5，分離效果好。

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關系考察

綠原酸的線性回歸方程為Y=755732X-27119，r=0.9993(n=6);甘松新酮的線性回歸方程為Y=368527X-8160，r=1(n=6)。結果表明綠原酸在0.1278～3.195μg，甘松新酮在0.3546～8.865μg范圍內線性關系良好。

2.2.2 精密度試驗

綠原酸峰面積的RSD為2.61%，甘松新酮峰面積的RSD為1.04%。結果表明儀器精密度符合要求。

2.2.3 重復性試驗

圖1 對照品和供試品HPLC圖

由實驗結果可知，綠原酸、甘松新酮的RSD分別為1.67%、1.04%。結果表明本方法重復性良好。

2.2.4 穩定性試驗

綠原酸峰面積的RSD為2.02%，甘松新酮峰面積的RSD為2.18%。結果表明樣品溶液在24h內穩定。

2.2.5 加樣回收率試驗

綠原酸、甘松新酮的平均回收率分別為99.2%，101.1%，RSD分別為1.73%，1.10%，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果(n=6)

2.3 樣品中綠原酸、甘松新酮的含量測定

按照“1.2.9”方法測定樣品中綠原酸、甘松新酮的含量，結果見表2。由表2可知，綠原酸含量在0.026%～0.355%，甘松新酮的含量在0.109%～2.013%。

表2 不同產地甘松藥材中綠原酸、甘松新酮的含量(n=2)

3 討論

3.1 提取方法的選擇

本實驗以綠原酸和甘松新酮為指標性成分，分別以甲醇、75%甲醇、50%甲醇、乙醇、75%乙醇、50%乙醇作為提取溶劑，采用超聲提取法和加熱回流提取方法提取，并對提取時間(30min，1h)和提取次數進行考察，結果表明，超聲提取法甘松新酮的含量明顯高于加熱回流法，兩種方法提取的綠原酸含量并無明顯差異。超聲法操作簡單，快速，故提取方法確定為樣品加入甲醇100mL超聲提取1h，提取2次。

3.2 檢測波長的選擇

對綠原酸和甘松新酮兩個對照品的甲醇溶液進行全波長掃描，掃描波譜顯示綠原酸最大吸收波長為330nm，甘松新酮最大吸收波長為254nm，為使兩種成分在同一波長下均有吸收，故本文選擇274nm作為檢測波長。

3.3 流動相的選擇

本實驗以甲醇-水為流動相，存在拖尾現象，因此在流動相加磷酸以改善拖尾現象，在此基礎上比較了甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水等洗脫溶劑，并比較了流速分別為0.8mL/min和1.0mL/min時兩種化合物的分離度，最終確定了流速為1.0mL/min時，兩種成分與雜質峰分離度良好的乙腈-0.1%磷酸水作為流動相進行梯度洗脫。

3.4 結果分析

本實驗建立了甘松中綠原酸和甘松新酮的含量的測定的分析方法，并采用此方法對25個產地的甘松藥材進行了含量測定。結果表明，綠原酸含量在0.026%～0.355%，甘松新酮的含量在0.109%～2.013%。由此可見，不同產地的甘松藥材含量差異較大，四川紅原縣的甘松新酮的含量高達2.013%，四川松潘縣山巴鄉的甘松中綠原酸含量高達0.355%，甘肅4個產地的甘松藥材中兩種成分的含量均較高，四川不同產區的甘松藥材含量有較大差異，可能是受生長的土壤、生長年限、采收季節和貯存時間等因素有關。本實驗采用高效液相法對不同產地的甘松藥材中綠原酸、甘松新酮的含量進行比較分析，為甘松藥材的質量控制規范化、標準化提供參考依據。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:79-80.

［2］萬新，石晉麗，劉勇，等.甘松屬植物化學成分與藥理作用［J］.國外醫藥(植物藥分冊)，2007，22(1):1-6.

［3］Surendra Kumar Sharma，Ajay Pal Singh.In Vitro Antioxidant and Free Radical Scavenging activity of Nardostachys jatamansi DC［J］.Journal of Acupuncture and Meridian Studies，2012，5(3):112-118.

［4］李琴.甘松新酮抗抑郁作用以及作用機制初探［D］.北京:北京中醫藥大學，2011.

［5］武姣姣，石晉麗，唐民科，等.甘松對動物行為絕望模型的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18(7):205-207.

［6］Liu Jian-hui，Yin Fei，Zheng Xu-xu.Nardostachys chinensis Glycoside Induces Characteristics of Neuronal differentiation in Rat Pheochromocytoma PC12 Cells［J］.Biol Pharm Bull，2005，28(4):768-771.

［7］Li Ping，Kimihiro Matsunaga.Nardosinone，the firstenhancer of neurite outgrowth-promoting activity of staurosporine and dibutyryl cyclic AMP in PC12D cells［J］.Developmental Brain Research，2003，1(45):177-183.

［8］李瑋，石晉麗，李琴，等.甘松新酮對缺糖缺氧損傷原代培養神經元的保護作用［J］.藥學學報，2013，48(9):1422-1429.

［9］張盼，程光宇，程為平.淺談甘松的臨床應用［J］.中醫藥學報，2015，43(2):99-100.

［10］劉穎，郭明曄.綠原酸的研究進展［J］.中藥材，2012，35(7):1180-1185.

［11］何躍，楊松濤，唐建軍，等.甘松不同提取成分組合給藥預防大鼠急性胃炎的實驗研究［J］.實用醫院臨床雜志，2011，8(1):27-29.