豬頸總動脈支架內再狹窄動物模型的建立及PPAR-γ與PI3K/Akt 和NF-кB 的表達變化

鄭 波，楊源潤，周振華，劉 渠，陳康寧

頸動脈支架植入治療作為一種微創、安全有效的方法，顯著降低卒中的復發及改善卒中的預后。但頸動脈支架植入術后支架內再狹窄的發生率約占2%～30%［1，2］，支架內再狹窄的發生嚴重影響支架植入術后的遠期療效，而且再狹窄的發生機制尚未明確。

關于支架內再狹窄的發生機制，目前研究認為血管內皮的損傷可能是支架內再狹窄的始動因素［3］，由于內皮損傷大量炎癥介質的釋放，可能激活核轉錄因子NF-кB(nuclear factor-кB，NF-кB)和PI3K/Akt(phosphatidyl Inositol 3-kinase/protein kinase b)的表達，從而促進血管平滑肌細胞增殖遷移及局部炎性反應，并通過復雜病理生理過程導致支架內再狹窄的發生［4，5］。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ)屬于核受體超家族成員，其作用功能非常廣泛［6，7］。本研究擬探索PPAR-γ 與支架內再狹窄的相關性。

由于豬頸總動脈支架植入術后再狹窄與人類頸動脈支架植入術后再狹窄在組織病理學變化方面基本相同，因此，本實驗采用豬股動脈暴露、頸總動脈球囊擴張及支架釋放的方法建立豬頸總動脈支架內再狹窄動脈模型，初步探討支架段血管PPAR-γ 與PI3K/Akt 及NF-кB 的表達的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 實驗用巴馬小香豬10 只，雌雄不限，月齡3～4 m，平均體重(19.2 ±1.4)kg，購自第三軍醫大學實驗動物中心。分為正常對照組(n=5)和支架植入組(n=5)，在普通環境中喂養，自由飲水。

1.1.2 主要藥物和試劑 阿司匹林腸溶片、硫酸氫氯吡格雷片、阿托品注射液、速眠新注射液、3%戊巴比妥鈉、碘海醇注射液(歐乃派克)、鼠抗豬單克隆NF-кB p65 抗體(GTX13594，GeneTex)、兔抗豬多克隆PPARG 抗體(AHP1461，abd serotec)、兔抗豬多克隆beta Actin 抗體(GTX16039，GeneTex)、兔抗豬多克隆Phospho-Akt (Ser473)和Akt 抗體(Cell Signiling，9271 和9272)。

1.1.3 主要器械和儀器 眼科剪、彎止血鉗、手術刀、5F 及8F RADIFOCUS INTRODUCER∥(RS＊A50K10SQ，TERUMO)、泥鰍導絲(0.035’，Cordis)、5F 造影導管及8F 導引導管(Cordis)、4 mm ×18 mm 金屬裸支架(Apollo，Microport)、2 mm×9 mm球囊(gateway，stryker)、4 mm×20 mm 球囊(Apollo，Microport)、數字減影血管造影機(DSA)(Artis floor，SIEMENS)、化學發光成像儀(IS4000MM)。

1.1.4 動物倫理 實驗過程符合動物倫理相關規定，并得到第三軍醫大學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 麻醉方法 術前禁食，肌注0.5 mg 阿托品，以0.1 ml/kg 速眠新肌注誘導麻醉，靜脈輸液針(0.7 ×22.5TWLB)沿耳緣靜脈建立通道并固定封管，3%戊巴比妥鈉以0.3 ml/kg 靜脈推注［8］，觀察生命體征及反應，可少量多次追加麻醉。

1.2.2 股動脈分離 將豬仰臥固定于手術臺，暴露右側腹股溝，備皮后常規消毒、鋪巾，逐層切開皮膚及皮下組織，暴露、游離股動脈約2 cm，將1 號絲線置于股動脈近心端及遠心端，結扎遠心端，穿刺針穿刺置鞘，置鞘成功后縫合固定動脈鞘。

1.2.3 豬頸總動脈支架植入 術前3 d 喂養阿斯匹林100 mg/d 和氯吡格雷75 mg/d，置鞘成功后靜推肝素2000 U。肝素生理鹽水潤濕器械，將金屬裸支架置于4 mm ×20 mm 球囊上備用。沿泥鰍導絲將8F 導引導管送至豬頸總動脈近端，將帶支架的球囊送至頸總動脈遠端，以1.1～1.2∶ 1 的比例在16 atm 持續30 s 下釋放支架，間隔60 s 后重復擴張一次，造影確認無嚴重內膜撕裂和血栓形成，且遠端血管顯影良好后退出導管及動脈鞘，結扎股動脈，縫合切口。正常對照組給予暴露股動脈、置鞘、結扎及縫合切口處理。術后3 d 均給予480 萬青霉素鈉抗感染，同時給予阿司匹林100 mg/d、氯吡格雷75 mg/d抗血小板聚集，直至動物處死。

1.2.4 血管造影及標本采集 術后3 m，行血管造影觀察支架段血管情況。造影結束后，靜推氯化鉀處死動物，采取頸總動脈支架段及臨近5 mm的血管標本，一部分放入4%多聚甲醛中，另一部分放入液氮中保存備用。

1.2.5 病理形態學檢查 將4%多聚甲醛固定的標本經石蠟包埋切片，行HE 染色。在4 倍物鏡下將完整的血管橫切面HE 染色圖像攝入計算機圖像分析系統中進行圖像編輯，逐步測算血管管腔面積、內彈力膜面積、新生內膜面積及管腔狹窄百分比。其中新生內膜面積=內彈力膜面積-管腔面積，管腔狹窄百分比=［1 -(管腔面積/內彈力膜面積)］×100%。

1.2.6 免 疫 組 化 染 色 檢 測NF-кB、P-Akt、PPAR-γ 標本經石蠟包埋、切片，用SP 法檢測NFкB、P-Akt、PPAR-γ 的表達，DAB 顯色，蘇木精復染。采用半定量積分法對切片結果進行分析:每張切片隨機選取5 個高倍鏡視野(×400)，分別計數100個細胞后根據陽性細胞百分率讀片，陽性細胞分級＜25%為1 分;26%～50%為2 分;51%～75%為3分;＞75%為4 分。根據染色強度讀片:無色為0分;淡棕色1 分;染色介于1 分與3 分之間為2 分;棕褐色3 分。兩種評分相乘并取5 個高倍視野的平均值為最終評分:陰性(＜1)、弱陽性(2～4)、陽性(5～8)、強陽性(＞9)，＞2 分為陽性結果。

1.2.7 Western blot 印跡檢測NF-кB、P-Akt、Akt、PPAR-γ 取出液氮中保存的標本提取蛋白，并采用BCA 法測量蛋白濃度，6%的SDS-PAGE 電泳約1.5 h，并電轉至PVDF 膜上，37 ℃封閉液封閉1.5 h;分別加入一抗于4 ℃孵育過夜;TBST 洗膜，二抗(1∶ 2 000 稀釋)37 ℃孵育1.5 h;TBST 洗膜，ECL 法顯影，用ImageJ 圖像分析系統分析圖像，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin 蛋白條帶灰度值的比值表示相對蛋白含量。

2 結果

2.1 建立豬頸總動脈支架內再狹窄動物模型術后3 m，DSA 檢查可見支架植入組頸總動脈支架植入段管腔明顯變細(見圖1)，HE 染色可見支架植入組標本明顯內膜增生、管腔狹窄(見圖2)。將HE 染色圖像攝入計算機圖像分析系統進行圖像編輯，可見兩組內彈力膜面積相仿，而支架植入組血管管腔面積明顯低于正常對照組、新生內膜面積和管腔狹窄百分比明顯高于正常對照組，兩組比較具有統計學意義(見表1)。

2.2 支架植入組支架段PPAR-γ 的表達變化采用Western blot 印跡法結果顯示，與正常對照組相比，支架植入組支架段PPAR-γ 表達明顯下降(0.4953 ±0.0498 vs 0.1782 ±0.0586，P ＜0.05，見圖3);免疫組織化學結果顯示，與正常對照組相比，支架植入組支架段標本棕褐色或棕黃色著色的陽性細胞明顯少于對照組(7.200 ±0.4899 vs 2.400 ±0.2449，P ＜0.05，見圖4)。

2.3 支架植入組支架段NF-кB 和P-Akt 的表達變化 采用Western blot 印跡法和免疫組織化學法檢測頸總動脈NF-кB、P-Akt 及Akt 的表達變化。術后3 m，與正常對照組相比，支架植入組支架段組織NF-кB 和P-Akt 表達明顯上調(0.0436 ±0.0298 vs 0.4185 ±0.0519;0.2926 ±0.0448 vs 0.3367 ±0.0512，P ＜0.05，見 圖3)，Akt 表 達 兩 組 相 仿(0.3238 ±0.0370 vs 0.3645 ±0.0422，P ＞0.05，見圖3)。術后3 m，正常對照組頸動脈血管壁NF-κB幾乎不表達，而支架植入組NF-κB 的表達明顯增高，達4.63±0.52(P ＜0.05，見圖4);術后3 m，正常對照組P-akt 表達為0.88 ±0.64，而支架植入組P-akt 表達明顯增加達4.63±0.52(P ＜0.05，見圖4)。

表1 正常對照組和支架植入組血管面積值(n=5，)

表1 正常對照組和支架植入組血管面積值(n=5，)

圖1 豬頸總動脈狹窄(3 m 后血管造影)。箭頭所示支架段血管狹窄

圖2 豬頸總動脈內膜增生(HE 染色100 ×)。A 代表內膜B 代表中膜;C 代表外膜

圖3 豬頸總動脈PPAR-γ、NF-кB、P-Akt 及Akt 的表達(Western blot 印跡)。與正常對照組相比，NF-кB 和P-Akt 表達明顯增加(P ＜0.05)，PPAR-γ 表達明顯下調(P ＜0.05)，Akt 表達兩組相仿(P ＞0.05)。A 代表正常對照組，B 代表支架植入組。圖4 豬頸總動脈PPARgamma、NF-кB、p-akt 的免疫組化染色。與正常對照組相比，NF-кB 和p-akt 表達明顯上調(P ＜0.05)，而PPAR-γ 表達明顯下調(P ＜0.05)

3 討論

3.1 豬頸總動脈支架植入再狹窄動物模型的建立 通過股動脈穿刺、頸總動脈球囊擴張及支架植入的方法行豬頸總動脈支架植入術，術后3 mDSA 造影可見支架內再狹窄形成，同時HE 染色行圖像編輯結果顯示支架植入組管腔面積再狹窄率達(23.65 ±6.35)%，進一步證實豬頸總動脈支架植入再狹窄動物模型的成功建立。對于支架內再狹窄動物模型的建立，既往通常采用球囊過度擴張(擴張比例為1.2～1.3∶ 1)、動脈內膜拉傷及輔以高脂高膽固醇飲食等方式［9］，這些方法經濟實用，其組織病理學表現與人類再狹窄結果十分相似，但與常規人類頸動脈狹窄的管理及治療具有很大差異。本實驗通過模擬人類頸動脈狹窄支架植入的操作方式及注意事項，并控制相關危險因素的前提下建立豬頸總動脈支架植入后再狹窄動物模型。我們的模型更加符合臨床研究需要，為下一步探索再狹窄機制提供依據。

3.2 手術操作的注意事項及與既往再狹窄研究的異同 既往通常采用球囊過度擴張及支架釋放建立支架內再狹窄模型，通過比較再狹窄的程度來確定不同支架類型(如金屬裸支架、藥物支架或自膨式支架、球擴式支架等)在防止再狹窄中的優勢［10］。目前對于支架內再狹窄治療研究較多的是藥物涂層支架和血管內放射，但是其遠期療效并不優于金屬裸支架。本實驗組以更加貼近臨床的方式建立支架內再狹窄模型，決定從支架植入后血管的病理生理改變進行研究，通過對血管病理生理機制的探索來預防支架內再狹窄的發生。

3.3 頸總動脈支架植入術后3 mPPAR-γ、NFкB 及PI3K/Akt 的表達變化 PPAR-γ 是由配體激活的核轉錄因子超家族成員，作用廣泛，具有抗炎、調節糖脂代謝及血管保護等功能［6，7］。然而，關于PPARγ 在頸動脈支架植入術后再狹窄機制中的研究甚少。本實驗發現支架植入術后3 m 支架組PPARγ的表達較正常對照組明顯降低，同時支架植入組支架內再狹窄明顯增加。因此，我們推測支架植入后下調PPAR-γ 的表達，從而降低了PPAR-γ 抗炎及血管保護等功能，從而導致了支架內再狹窄的發生。

支架釋放時內膜損傷產生大量炎性介質及支架異物刺激等因素促進了NF-кB 的表達，可能通過各種病理生理過程導致支架內新生內膜的形成及支架內再狹窄的發生［4］。本實驗研究發現支架植入組術后NF-кB 的表達明顯增加，伴有明顯的支架內再狹窄，進一步證實支架植入后通過上調NF-кB 的表達，從而加重支架內再狹窄的發生。

在血管平滑肌細胞中，血管平滑肌增殖遷移的基礎是PI3K/AKT 通路的激活［11］。我們研究發現:支架植入術后3 m，支架組P-Akt 蛋白表達水平較正常對照組明顯增加(P ＜0.05)，Akt 蛋白表達量在兩組中無統計學意義。我們認為支架植入后血管病理生理學改變通過激活PI3K/AKT 通路促進血管平滑肌細胞的增殖遷移，從而加重支架內再狹窄的發生。

3.4 支架植入術后NF-кB、PI3K/Akt、PPAR-γ的表達變化與支架內再狹窄之間的關系 本實驗研究得知，豬頸總動脈支架植入術后3 m，NF-кB 和p-Akt 表達明顯增加，而PPAR-γ 表達明顯下調。我們推測:支架植入術后PPAR-γ 表達下調，對血管炎性反應、血管平滑肌細胞增殖遷移及內膜增生等抑制作用減弱，從而加重支架內再狹窄的發生。目前，關于PPAR-γ 調控支架內再狹窄的具體機制尚不明確，通過對豬頸總動脈支架內再狹窄模型的研究，明確金屬裸支架植入后頸總動脈均發生了支架內再狹窄。在此前提下，我們可以建立兩組動物模型:支架植入后，一組口服PPAR-γ 激動劑;另一組使用安慰劑，術后3 m 評估血管情況及提取標本行進一步研究，從而探索PPAR-γ 調控支架內再狹窄的具體機制，進而為臨床治療提供理論依據。

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