MMP-9 在單純皰疹病毒性腦炎中的表達及對血腦屏障的影響

周 瑜，曾艷平，周 琴，關景霞，盧祖能

單純皰疹病毒性腦炎(herpes simplex encephalitis，HSE)是臨床上常見的中樞神經系統感染疾病，導致腦組織出血壞死性損害，神經功能障礙較嚴重，但其具體的病理機制尚不明確。研究發現，小膠質細胞激活介導的繼發性免疫損傷在其中起著關鍵的作用［1，2］。在腦損傷的各種病理因素中，基質金屬蛋白酶(MMPs)的作用受到廣泛關注，MMPs，尤其是MMP-9 可以促進腦組織毛細血管破壞，導致腦組織繼發性腦水腫和腦出血［3，4］。MMP-9 在HSE 發病機制中的作用尚不清楚，本實驗探討HSE 中MMP-9 的表達及其對血腦屏障的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 3 周齡Balb/c 雄性小鼠95只，體重11～13 g，購自湖北省實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 HSV-1 病毒和Vero 細胞由華中科技大學武漢協和醫院中心實驗室病毒室惠贈，H-DMEM 培養基、新生牛血清購自Gibco 公司，胰酶(Trypsin)購自美國AMRESCO 公司，抗體均購自美國eBioscience 公司，BB-94 購自British Biotech Pharmaceuticals 公司，明膠(gelatin)購自美國Sigma公司。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)，臺式高速離心機(上海醫用分析儀器廠)，CO2恒溫細胞培養箱(美國Napco 5410-220)，低溫離心機(美國Beckman 公司)，微量加樣器(美國基爾森公司)，低溫冰柜(日本MDF-382E)，恒溫水浴箱(重慶萬達有限公司)，解剖剪、鑷(上海醫療儀器廠)，血細胞計數板(西安化學試劑廠)，相差顯微鏡(日本Olympus)，激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus Fluoview FV500 Imaging System)，6、24 孔培養板(美國Gibco 公司)，一次性細胞培養瓶(美國Corning-Costar 公司)。

1.2 方法

1.2.1 病毒的滴定 HSV-1 病毒通過Vero 細胞中培養增殖后收集上清液，用維持液［含5%(體積分數)新生牛血清的DMEM 培養基］10 倍系列稀釋，Vero 細胞于96 孔板中長成單層細胞，接種系列稀釋的病毒液，對照孔和感染病毒孔均加入100 μl維持液。37 ℃、5%(體積分數)CO2細胞培養箱孵育。每天觀察并記錄出現細胞病變(細胞折光性增強、細胞變大變圓或融合性病變)的孔數。細胞病變不再發展時，經Reed-Muench 法計算TCID50 病毒滴度為10～5/20 μl，選擇100 倍TCID50 病毒滴度10～3/20 μl 接種小鼠。

1.2.2 實驗分組 實驗小鼠20 只分為對照組和病毒組各10 只，觀察14 d 內小鼠的發病情況及存活率，留取腦組織行病理切片。30 只隨機分為對照組和病毒組，每組15 只，用于明膠酶譜及免疫熒光共聚焦檢測。另取45 只小鼠分為對照組、病毒組、BB-94 處理組各15 只，用于腦組織水含量及血腦屏障通透性分析。

1.2.3 動物模型 按體質量3.5 ml/kg 予小鼠10%(體積分數)水合氯醛腹腔注射麻醉后，從右側眼外眥與外耳道口連線中點處進針2～3 mm，向顱內注入HSV-1 制造HSE 模型。對照組注入細胞培養上清液20 μl，病毒組注入病毒液20 μl，BB-94處理組在注入病毒液20 μl 后12 h 給予BB-94(30 mg/kg)腹腔注射。

1.2.4 腦組織MMP-9 及MMP-2 明膠酶譜檢測 分別于感染后第3 天、第7 天，每組小鼠取3 只深度麻醉后斷頭，取腦組織約0.2 g 在1 ml 冷勻漿緩沖液中勻漿，超聲20 s 后，4 ℃12 000 ×g，離心15 min，收集上清，考馬斯亮藍法測定各樣品中蛋白含量，隨后上樣于含1 mg/ml 明膠的10% SDSPAGE，電泳。電泳后，凝膠在50 mmol/L Tris-HCl buffer (pH 7.6，2.5% Triton X-100，5 mmol/L CaCl2，1 μmol/L ZnCl2)中漂洗兩次，每次45 min;之后在50 mmol/L Tris-HCl buffer (pH 7.6，5 mmol/L CaCl2，1 μmol/L ZnCl2)中再漂洗兩次，每次30 min;在孵育液［50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6)，5 mmol/L CaCl2，1 μmol/L ZnCl2，0.02% Brij-35］中于37 ℃孵育42 h，使上樣液電泳后條帶中的金屬蛋白酶充分降解凝膠中的明膠底物，之后凝膠經考馬斯亮蘭R-250 染色3 h，然后脫色，即可見在相應質量金屬蛋白酶所在條帶明膠降解處，為白色透明條帶，而其余凝膠背景為藍色。利用激光掃描光密度分析法半定量分析掃描條帶。

1.2.5 腦組織MMP-9 免疫熒光共聚焦檢測感染后第3 天，取3 只病毒組小鼠深度麻醉后斷頭，取右側大腦半球行冰凍切片，3% BSA(用TBS 稀釋)于室溫下封閉1 h;傾去封閉液，按1∶ 100 稀釋比加入一抗200 μl (兔抗OX-42 IgG，一抗稀釋液為含3% BSA 的TBS，pH 7.2，含0.02% NaN3)，37 ℃孵育60 min，PBS(含0.3% TritonX-100)沖洗5 min×3;滴加熒光素標記的二抗(1%BSA-PBS 1∶ 100稀釋)200 μl，37 ℃孵育45 min，PBS 沖洗5 min×3;滴加三抗200 μl(羊抗MMP-9 IgG，稀釋比為1 ∶100)和熒光素標記的四抗200 μl(1% BSA-PBS 1∶100 稀釋)并重復上述孵育及PBS 沖洗步驟。異硫氰酸熒光素(FITC，顯綠色熒光)標記OX-42，Cy3 熒光素(顯紅色熒光)標記MMP-9。甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.6 腦組織含水量檢測 病毒感染后第3天、第7 天，將各組小鼠各3 只深度麻醉后斷頭，取右側大腦半球，精密電子天平稱濕重(wwt);置80 ℃烤箱中，連續烘烤48 h 至恒重(最后兩次質量差≤0.2 mg)后稱干重(dw)。按Elliott 公式計算腦組織含水量(%)。腦組織含水量(%)=(wwt -dw)/wwt×100%。

1.2.7 腦組織血腦屏障通透性的測定 各組鼠3 只在相應時間點麻醉后，經尾靜脈注入4% EB(160 mg/kg)，觀察小鼠眼球結膜、四肢，于注射后幾秒鐘變藍，表明注入成功。2 h 后開胸通過左心室灌注生理鹽水，直至右心房流出無色液體。斷頭取右側大腦半球，稱重后加入2 ml 甲酰胺，54 ℃恒溫水浴箱中，孵育24 h。將溶有EB 的甲酰胺溶液過濾，用分光光度計(λ=610 nm)檢測光密度值。根據EB 標準曲線計算腦組織EB 含量(ng/mg)。

1.3 統計學分析 采用SPSS 13.0 統計軟件進行統計學分析，采用One-Way ANOVA 法進行檢驗。數據均以均數± 標準差(χ ± s)表示，以P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠生存狀況 各組小鼠在HSV-1 感染后14 d 內作生存率觀察，對照組至第14 天結束時均存活，病毒組小鼠于病毒感染后第3 天開始發病，表現為消瘦、聳毛、蜷縮、肢體麻痹、低反應性、衰竭和死亡。感染后第5～6 天癥狀達高峰，并多于2 d內死亡，14 d 結束時病死率為100%。

2.2 HSV-1 感染后腦組織MMP-9、MMP-2 表達活性 明膠酶譜實驗顯示，在相對分子質量標準92 kb、72 kb 處均出現明顯的透明酶解帶，分別為MMP-9、MMP-2 對應條帶。對條帶進行掃描分析(條帶吸收峰值)，結果以對照組腦組織明膠酶活性水平標準化，分析數據顯示，HSV-1 病毒感染后3 d和7 d，腦組織中有較高MMP-9 活性水平，分別為對照組的1.98 ±0.22、2.18 ±0.16 倍。而腦組織中MMP-2 活性水平在病毒感染后無顯著改變(見圖1A、1B)。

2.3 免疫熒光觀察腦組織MMP-9 表達 免疫熒光共聚焦顯示，MMP-9 主要在OX-42 陽性細胞中表達，表明單純皰疹病毒性腦炎中激活的小膠質細胞是MMP-9 的主要來源(見圖2)。

2.4 病毒感染后腦組織水含量及血腦屏障通透性的變化 HSV-1 感染后破壞血腦屏障，與對照組比較，腦組織水含量與血腦屏障通透性在感染后第3 天和第7 天均顯著增加(P ＜0.05)，MMP-9 抑制劑BB-94 處理組可見血腦屏障通透性較病毒組降低，腦組織水含量亦下降(見表1)。

表1 腦組織血腦屏障通透性及水含量的變化(，n=3)

表1 腦組織血腦屏障通透性及水含量的變化(，n=3)

注:與對照組比較* P ＜0.05;與病毒組比較#P ＜0.05

圖1 HSV-1 感染后腦組織MMP-9、MMP-2 表達活性與對照組比較* P ＜0.01

3 討論

HSV-1 所致單純皰疹病毒性腦炎目前病死率仍高達20%，半數以上的患者常遺留嚴重的神經功能缺損［5］。研究發現，HSV-1 主要從兩個方面造成神經損害:(1)病毒復制增殖直接造成神經細胞和神經膠質細胞的損害;(2)病毒激活了顱內的免疫炎癥過程，并不斷擴大，引起腦組織的免疫病理損傷，包括腦水腫、顱內壓增高和出血壞死。HSE 患者長期存在免疫激活反應，與患者不良的預后和嚴重后遺癥相關［6］，即使早期給予抗病毒治療，預后仍不佳。因此，較之病毒的直接損害作用，病毒感染后繼發的炎性反應在病理過程中可能起著關鍵作用。

單純皰疹病毒性腦炎后血腦屏障破壞導致腦炎后腦水腫、顱內高壓及相關并發癥的產生，直接影響到患者的生存率和神經功能的恢復。基質金屬蛋白酶(MMPs)破壞血腦屏障、影響神經血管單位的完整性，在促進炎性損害過程中起著重要的作用［7，8］。神經血管基質的破壞，外周炎性細胞侵入中樞神經系統，可進一步觸發腦血管并發癥，加重繼發性病理損傷［9］。Ⅳ型膠原、層粘連蛋白以及纖維結合素是血管細胞外基質骨架的主要組成部分，基質金屬蛋白酶中明膠酶A(MMP-2)和明膠酶B(MMP-9)是破壞血腦屏障的主要成分，在病毒性腦膜炎患者腦脊液及血清中MMP-9 水平均增加［10，11］。但MMPs 在單純皰疹病毒性腦炎病理損傷中的作用尚不明確。

本研究發現，在病毒感染后第3 天，即單純皰疹病毒性腦炎早期，MMP-9 表達明顯增高，到第7 天時活性水平更高，相應的血腦屏障的通透性增高，腦組織水含量增加，腦水腫加重。但MMP-2 的表達在病毒感染后第3 天、第7 天并未見明顯改變。表明單純皰疹病毒性腦炎中，MMP-9 而非MMP-2 在其病理機制中發揮重要作用。進一步我們觀察到使用MMP-9 抑制劑BB-94 組小鼠腦組織EB 含量及水含量均較病毒組明顯降低，說明BB-94 可以保護血腦屏障的通透性，從而減輕腦水腫。

圖2 腦組織MMP-9、OX-42 免疫熒光共聚焦

小膠質細胞作為存在于腦中的單核細胞，被認為具有抗原提呈、分泌細胞因子及吞噬作用，在多種病毒性腦炎中的作用受到日益關注［12］。小膠質細胞激活在病毒性腦炎中具有雙重作用(抗病毒或免疫損傷)，在HSE 中病毒可促發小膠質細胞產生一系列強有力的免疫炎性反應，但并不能保護小鼠的發病與死亡［13］。HSV-1 可通過Toll 樣受體2(Tolllike receptor 2，TLR-2)誘發顱內的炎性反應，TLR-2基因敲除小鼠病毒感染后炎癥因子表達減少，并顯著提高了小鼠的存活率［14］。本實驗中我們發現MMP-9 主要在OX-42 陽性細胞中表達，表明激活的小膠質細胞是MMP-9 的主要來源。我們推測病毒感染后激活腦內小膠質細胞，表達MMP-9 及系列炎性因子，破壞腦實質的神經血管基質結構，形成典型的出血壞死性病理改變。

通過本實驗的初步研究表明，小膠質細胞激活表達的MMP-9 在單純皰疹病毒性腦炎發病機制中起著重要作用，通過抑制MMP-9 的表達有可能為治療單純皰疹病毒性腦炎提供新的治療策略。

［1］Wang JP，Bowen GN，Zhou S，et al.Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system［J］.J Virol，2012，86(4):2273-2281.

［2］Conrady CD，Zheng M，van Rooijen N，et al.Microglia and a functional type I IFN pathway are required to counter HSV-1-driven brain lateral ventricle enlargement and encephalitis［J］.J Immunol，2013，190(6):2807-2817.

［3］Vilalta A，Sahuquillo Barris J，Poca MA.Matrix metaloproteinases inneurological brain lesions:a new therapeutic target［J］.Rev Neurol，2010，51(2):95-107.

［4］Min H，Hong J，Cho IH，et al.TLR2-induced astrocyte MMP9 activation compromises the blood brain barrier and exacerbates intracerebral hemorrhage in animal models［J］.Mol Brain，2015，8:23.

［5］Andrei G，Snoeck R.Herpes simplex virus drug-resistance:new mutations and insights［J］.Curr Opin Infect Dis，2013，26(6):551-560.

［6］Marques CP，Cheeran MC，Palmquist JM，et al.Prolonged microglial cell activation and lymphocyte infiltration following experimental herpes encephalitis［J］.J Immunol，2008，181(9):6417-6426.

［7］Cunningham LA，Wetzel M，Rosenberg GA.Multiple roles for MMPs and TIMPs in cerebral ischemia［J］.Glia，2005，50 (4):329-339.

［8］Yang Y，Thompson JF，Taheri S，et al.Early inhibition of MMP activity in ischemic rat brain promotes expression of tight junction proteins and angiogenesis during recovery［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2013，33(7):1104-1114.

［9］Sashindranath M，Sales E，Daglas M，et al.The tissue-type plasminogen activator-plasminogen activator inhibitor 1 complex promotes neurovascular injury in brain trauma:evidence from mice and humans［J］.Brain，2012，135(11):3251-3264.

［10］Candelario-Jalil E，Yang Y，Rosenberg GA.Diverse roles of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in neuroinflammation and cerebral ischemia［J］.Neuroscience，2009，158(3):983-994.

［11］Kolb SA，Lahrtz F，Paul R，et al.Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in viral meningitis:upregulation of MMP-9 and TIMP-1 in cerebrospinal fluid［J］.J Neuroimmunol，1998，84(2):143-150.

［12］Hanisch UK，Kettenmann H.Microglia:active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain［J］.Nat Neurosci，2007，10(11):1387-1394.

［13］Lundberg P，Ramakrishna C，Brown J，et al.The immune response to herpes simplex virus type 1 infection in susceptible mice is a major cause of central nervous system pathology resulting in fatal encephalitis［J］.J Virol，2008，82(14):7078-7088.

［14］Kurt-Jones EA，Chan M，Zhou S，et al.Herpes simplex virus 1 interaction with Toll-like receptor 2 contributes to lethal encephalitis［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(5):1315-1320.