下調IGF-1 通過CREB 信號通路失活間接加重大鼠腦缺血損傷

閔曉黎，王廷勇，劉 佳，王廷華

缺血性腦血管疾病的發病率逐年上升，具有高致死率和致殘率的特點［1］，嚴重危害人類生命和健康，帶來沉重經濟負擔。腦缺血發生后，由于腦血流中斷導致局部供血區域缺血缺氧而促發一系列復雜的病理生理學變化，包括氧化應激、鈣超載、興奮性氨基酸毒性、膠質細胞活化［2］、炎性反應［3］等，最終引起神經細胞凋亡、不可逆性死亡，出現嚴重神經功能缺損。進一步深入探討腦缺血的病理發生機制，尋找潛在干預靶點，可為臨床制定有效治療、預防策略提供理論依據，具有深遠臨床意義。

胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor-1，IGF-1)屬于神經營養因子(neurotrophic factors，NTFs)大家族中的一員，參與了腦缺血后的神經保護作用。然而，在腦缺血發生后IGF-1 的表達變化模式究竟是上調還是下調，目前不同研究對此眾說不一，同時，對IGF-1 在永久性局灶性腦缺血中所涉及的細胞內信號通路及其下游作用蛋白的研究也不完善。因此，本實驗通過檢測MCAO 永久性局灶性腦缺血大鼠大腦皮質中IGF-1 的表達變化，以及信號轉導分子MEK、ERK 和CREB 的活化情況，來證實IGF-1 是否通過MEK/ERK/CREB 信號通路發揮其功能，進一步探討IGF-1 在腦缺血病理生理過程中的作用及作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 健康成年雄性SD 大鼠62 只，體重220～250 g，購自四川大學華西醫學實驗動物中心，隨機分為MCAO 永久性局灶性腦缺血組(CI 組，n=31)和假手術組(Sham 組，n=31)，每組5 只用于mNSS 評分、5 只用于TTC 染色、5 只用于TUNEL 檢測、8 只用于qRT-PCR 檢測、8 只用于Western blot 檢測，具體分組情況及實驗動物用途(見表1)。所有動物實驗操作均得到四川大學華西醫學院動物倫理委員會(M43-07)批準和認可。

表1 實驗動物分組及用途

1.2 MCAO 永久性局灶性腦缺血模型制備3.6%水合氯醛腹腔注射麻醉，1 ml/100 g。將大鼠仰臥固定于鼠板上，頸部備皮，75%酒精消毒，剪開頸部皮膚，組織鑷鈍性分離各層皮下組織，分離暴露出頸總、頸內和頸外動脈，將頂端加熱成球面的MCAO 單絲尼龍線栓(直徑0.34 cm±0.02 cm)沿頸外動脈插入，進入頸內動脈直至大腦中動脈(MCA)起始處阻斷其血流，進線深度距離頸總動脈分叉處約18 mm。然后縫線固定線栓外側端，縫合皮下組織和皮膚，局部碘伏消毒，維持大腦中動脈閉塞，造成永久性局灶性腦缺血。術后腹腔注射青霉素2 ×104U/(kg·d)。假手術組大鼠僅將MCAO 線栓插入至右側頸內動脈起始端，其余步驟全部同腦缺血組大鼠。

1.3 樣本獲取 實驗組和假手術組大鼠于術后48 h，用3.6%水合氯醛(1 ml/100 g)腹腔內注射麻醉，斷頭取腦，取材新鮮完整全腦沿冠狀位切成2 cm厚度的切片用于TTC 染色，取材缺血同側大腦皮質后放入冰凍切片機中切成5 μm 厚度的切片用于TUNEL/DAPI 免疫熒光染色，取材新鮮缺血同側大腦皮質即刻凍存于-80 ℃備用于qRT-PCR 和Western blot 檢測IGF-1 及相關下游信號轉導分子的基因和蛋白質表達變化。

1.4 神經功能評價 參照mNSS(modified Neurological Severity Score)評分標準，分別于術后6 h、12 h、24 h 和48 h，對所有實驗大鼠進行神經功能評分。評分項目包括運動功能、感覺功能、行走測試、平衡測試、反射缺失和反常運動。總分18 分，1～6 分為輕度損傷;7～12 分為中度損傷;13～18 分為重度損傷。評分人員經過培訓且不參與模型制作，每只大鼠由3 名受過專業培訓的評分人員分別進行盲評。

1.5 TTC 染色 新鮮完整全腦取出后放入腦切片模具，-20 ℃迅速冷凍10 min，至不軟不硬適合切片為宜。沿冠狀位自腦前極至后極均勻切成厚度為2 cm 的厚片，浸入2%TTC(三苯基氯化四氮唑)溶液中37 ℃避光孵育30 min。至染色均勻后，取出染色的腦片，用4%多聚甲醛溶液固定，拍照觀察腦梗死程度和范圍。

1.6 TUNEL/DAPI 免疫熒光染色 缺血同側皮質新鮮腦組織冰凍切片采用脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)法染色觀察組織細胞在凋亡過程中細胞核DNA 斷裂情況，按照羅氏熒光原位細胞凋亡檢測試劑盒(in situ cell death detection kit，TMR red，Roche 公司，德國)的操作步驟進行。簡言之，新鮮腦組織切片經4%多聚甲醛溶液固定后，用0.1 mol PBS 溶液漂洗5 min ×3 次，3%過氧化氫常溫封閉15 min，添加新鮮制備的0.1% Trion X-100 +0.1%檸檬酸鈉常溫打孔10 min，PBS 漂洗5 min ×3次，添加酶液:標記液=1∶ 9 的TUNEL 反應混合物避光孵育4 ℃過夜。再用PBS 漂洗5 min ×3 次，滴加DAPI 室溫孵育5 min 復染細胞核。蓋玻片封片，熒光顯微鏡(Leica，CM1860，德國)下觀察組織細胞凋亡情況并采集熒光圖像，每張切片隨機選取5 個視野，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件(MediaCybernetics 公司，美國)計數TUNEL 陽性凋亡細胞百分比。

1.7 實時熒光定量PCR 檢測 取實驗組缺血同側大腦皮質和sham 組對應大腦皮質，采用Taqman 探針法實時熒光定量PCR 檢測IGF-1，MEK，ERK 和CREB 的基因表達量。根據RNA 提取試劑盒和逆轉錄試劑盒(Qiagen 公司，美國)說明書將組織裂解抽提總RNA，逆轉錄合成cDNA 第一鏈。然后以cDNA 鏈為模板，在ABI 7000 PCR 儀(Applied Biosystems 公司，美國)上進行PCR 擴增反應，反應條件如下:94 ℃預變性2 min，95 ℃變性10 s，51 ℃退火30 s，60℃延伸30 s，循環40 次。引物序列為:β-actin(227 bp):上游引物5'GTAAAGACCTCTATGCCAACA3’，下游引物5'GGACTCATCGTACTCCTGCT3’;MEK (758bp):上 游 引 物 5'TGACGCAGAAGCAGAAGGTG 3’，下游引物5'AGGTCGGCTATCCATTCCAT 3’;ERK(382 bp):上游引物5＇'TCAAGCCTTCCAACCTCCT 3’，下游引物5'TGTTCCACGGCACCTTATTT 3’;CREB(792 bp):上游引物5'CAGATTGCCACATTAGCCC3’，下游引物5'TTCCCTGTTCTTCATTAGACG 3’。根據每個反應的動力學曲線確定每個樣品管中熒光強度增量達到閾值時的循環數作為Ct 值，分別讀取各個樣本的待測基因與內參照基因的Ct 值，與β-actin 進行校正后，采用2-ΔΔCt法計算樣本中的每個待測mRNA 相對于內參β-actin 基因的相對表達量。每個樣本進行兩次重復實驗。

1.8 Western blot 檢測 待測組織稱重后加入新鮮配制含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，冰盒中勻漿，超聲波細胞粉碎機粉碎，低溫離心12，000 rmp 15 min，提取組織總蛋白。取2 μl 進行BCA 法蛋白質濃度測定并繪制標準曲線，剩余總蛋白液加入5 ×上樣緩沖液混勻后沸水浴5 min 變性。取等量蛋白液上樣于新鮮配制8%SDS/PAGE 凝膠電泳90 min后，轉移至PVDF 膜上。TBST 液漂洗5 min，蛋白面向上浸沒于5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h。加入一抗(濃度均為1∶ 500，CST 公司)4 ℃孵育過夜，抗體型號分別為:ERK(9102)、p-ERK1/2 (9101)、MEK(9146)、p-MEK(9127);β-actin(濃度1∶ 10000，Abcam 公司，美國)作為內參。TBST 液漂洗5 min ×3次，水平鐘擺式搖床上室溫輕搖2 h 辣根過氧化物酶二抗孵育，再次漂洗TBST 液5 min ×3 次。之后，采用HRP-ECL 發光法，加入按比例稀釋混合的A、B 發光液，于凝膠成像儀采集圖像信息，使用Photoshop 6.0 軟件(Adobe 公司，美國)測定相對光密度值。

2 結果

2.1 神經功能缺損評分 腦缺血(CI)組大鼠于清醒后均出現神經功能缺失體征，表現為運動、感覺、平衡功能和生理反射不同程度受損，mNSS 評分于術后6 h 開始逐漸升高，至術后1 d 達峰，術后2 d仍維持在較高水平。假手術(Sham)組大鼠mNSS 評分一直處于較低的水平，而腦缺血(CI)組大鼠各時間點的mNSS 評分均遠遠高于Sham 組，組間比較有顯著統計學差異(P ＜0.01，見圖1)。

2.2 TTC 染色觀察腦梗死范圍 新鮮腦組織冠狀位切片經TTC 染色后，正常腦組織呈紅色，梗死區為蒼白色，與周圍正常腦組織分界清晰。Sham 組各腦片TTC 染色呈現均勻一致的紅色，而CI 組TTC 染色可見明顯大腦皮質和皮質下白色梗死區，梗死區域符合手術栓塞的大腦中動脈供血范圍(見圖2)。

2.3 TUNEL 檢測并計數凋亡細胞 TUNEL 染色陽性細胞在熒光顯微鏡下呈紅色熒光，凋亡細胞核固縮濃染，體積縮小，形態不規則。DAPI 染料可將腦組織內所有細胞核染色，呈藍色熒光。觀察紅色熒光細胞與藍色熒光細胞核的重疊情況，結果發現，Sham組大腦皮質未見明顯凋亡細胞，發紅色熒光的TUNEL染色陽性細胞數極少;而CI 組大腦皮質則存在明顯凋亡，TUNEL 染色陽性細胞計數遠遠超過Sham 組，組間比較有顯著統計學差異(P ＜0.01，見圖3)。

2.4 IGF-1 和MEK/ERK/CREB 信號分子mRNA 的表達變化 與Sham 組比較，大鼠MCAO 永久性局灶性腦缺血48 h 同側大腦皮質中胰島素樣生長因子IGF-1 的mRNA 表達明顯下調(P ＜0.01);與此同時，細胞內下游信號轉導分子MEK 的mRNA 表達明顯減少(P ＜0.01)，ERK 的mRNA 表達也比Sham組減少(P ＜0.05);核內轉錄調控因子CREB 的mRNA 表達也出現下調(P ＜0.05，見圖4)。

2.5 信號分子磷酸化蛋白的表達變化 通過Western blot 方法檢測各組細胞內信號轉導分子MEK 和ERK 的總蛋白及其各自磷酸化蛋白的表達水平，結果發現CI 組缺血同側大腦皮質MEK 和ERK 的總蛋白表達水平均低于Sham 組(P ＜0.05)，磷酸化的MEK 和ERK1/2 蛋白表達水平更是明顯低于Sham 組(P ＜0.01，見圖5)。

3 討論

本研究中TTC 染色顯示實驗組大鼠栓塞同側大腦皮質及皮質下區出現明顯白色腦梗死灶，與周圍紅色正常腦組織分界清晰。與此相對應，實驗組大鼠術后神經功能出現不同程度受損，各時間點mNSS評分呈逐漸上升趨勢，且明顯高于假手術組。這些結果證實了我們的動物模型制備成功，可用于進行后續的實驗研究。另外，與假手術組比較，實驗組大鼠的缺血同側皮質內TUNEL 染色陽性細胞數明顯增加，提示腦缺血引起了神經細胞的凋亡，與以往大多數研究結果一致［4］。

神經營養因子(NTFs)是一大類小分子多肽或蛋白質，由靶細胞合成分泌，并與其相應受體結合，直接啟動效應神經元細胞和非神經元細胞的存活、生長、分化等一系列生物學過程，而且還與神經損傷、修復、免疫、炎癥［5］等密切相關，在腦缺血的病理發生機制中也發揮重要作用［6］。胰島素樣生長因子(IGF-1)屬于神經營養因子大家族中的重要一員，參與了腦缺血后的神經保護作用。然而，在腦缺血發生后IGF-1 的表達變化模式究竟是上調還是下調，目前不同研究并沒有得出一致性的結果。有研究顯示，腦缺血中防御性因子IGF-1 和攻擊性因子5-脂氧合酶(5-LO)同時發揮重要作用，二者在大鼠腦缺血再灌注24 h 時表達上升達高峰［7］。而在猴子MCAO 局灶性腦缺血24 h 時，缺血同側紋狀體內IGF-1 的mRNA 和蛋白表達水平均下調，但在海馬內IGF-1 的mRNA 表達上調而其蛋白水平不變［8］。而在本研究中發現，大鼠MCAO 永久性局灶性腦缺血48 h 時，缺血同側皮質內IGF-1 的基因表達水平明顯下降。分析原因可能與各研究所使用的動物模型不同、檢測時間點不同有關，從而造成內源性IGF-1在腦缺血不同部位的表達模式存在差異。

IGF-1 在腦缺血中主要起神經保護作用，能夠減少細胞凋亡、促進神經元存活及其活力［9］、促進神經再生和新生血管形成［10］，從而減輕缺血性組織損傷、縮小腦梗死體積、改善缺損神經功能恢復［11］。相反，若是降低IGF-1 的水平，則能通過抑制下游信號分子Akt 的磷酸化［12］，繼而抑制細胞周期蛋白D1(CCD1)的活化［16］，而減弱IGF-1 的促神經元存活和促神經祖細胞增殖的腦缺血后保護作用。本研究中實驗組大鼠缺血皮質IGF-1 水平明顯下降，而TUNEL 染色陽性細胞數明顯增加，神經細胞凋亡比假手術組明顯，提示IGF-1 的下調在局灶性腦缺血早期發揮負向調控作用。

本研究還發現細胞內信號分子MEK(絲裂原激活蛋白激酶，mitogen-activated protein kinase)、ERK(細胞外信號調節激酶，extracellular signal-regulated kinase)的磷酸化蛋白水平在實驗組大鼠缺血皮質中明顯下降，提示MEK 和ERK 的活性受到抑制。目前，ERK 相關信號通路主要包括以下3 大類:(1)NTF →receptor →Grb2-sos →Ras →GTP →Raf-1 →MEK →ERK;(2)NTFs →receptor →PI3K →3'PI(PDK-1)→AKT →Raf-1 →MEK →ERK;(3)NTFs→receptor →PLC-γ →PKC →Raf-1 →MEK →ERK。可以看出，MEK 是ERK 的上游，如果MEK 的表達降低，將會引起ERK 的失活。本研究結果證實在MEK活性降低的同時，ERK 的活性也受到抑制。

已有文獻報道IGF-1 所發揮的腦缺血神經保護作用主要通過活化下游PI3K/Akt［13～16］和ERK/MAPK［17］信號通路所介導，但是目前關于IGF-1 在永久性局灶性腦缺血中所涉及的細胞內信號通路及其下游作用蛋白的研究尚不完善。CREB(cAMP response element-binding protein，cAMP 反應元件結合蛋白)作為一個真核生物細胞核內重要的轉錄調控因子，結合在DNA 的CRE 元件上，促進含有該元件的基因的轉錄，包括BDNF、bcl-2、c-myc、c-Jun 和絡氨酸羥化酶等。CREB 受多種激酶的激活，激活標志是其133 位絲氨酸的磷酸化。磷酸化而激活的ERK也可以激活CREB。有實驗表明大鼠局灶性腦缺血90 min/再灌注7 d 缺血半暗帶的ERK/CREB 信號通路被激活，通過下游BDNF 和VEGF 的增加，引起BrdU-NeuN 雙標(+)的新生神經元數量增多［18］。核外雌激素受體(ER)激活后能通過ERK/Akt/CREB/BDNF 途徑，減少全腦缺血大鼠海馬CA1區神經元的缺血性損傷。

圖1 大鼠mNSS 評分在不同時間點的變化趨勢

圖2 TTC 染色顯示腦梗死情況

圖3 大鼠皮質TUNEL/DAPI 免疫熒光染色檢測細胞凋亡

圖4 大鼠腦缺血同側皮質內IGF-1 和下游信號分子MEK/ERK/CREB mRNA 的表達變化(* P ＜0.05 vs Sham，＊＊P ＜0.01 vs Sham)

圖5 大鼠腦缺血同側皮質內信號分子MEK 和ERK 1/2 及其磷酸化蛋白的表達變化

這些研究提示ERK/CREB 信號通路在腦缺血中主要發揮腦保護作用。本研究中不僅發現MEK和ERK 的mRNA 及其磷酸化蛋白表達水平下降，還發現CREB 基因的表達水平也隨之降低，提示失活的MEK/ERK 信號通路可能抑制了下游CREB 信號分子的活性。

CREB 上游激酶能被神經營養因子及其受體所激活，因此我們推測IGF-1 也可能通過MEK/ERK/CREB 信號通路發揮作用。有研究使用雌二醇長期預處理或急性腦缺血后單獨腦室內注射后處理，均可通過細胞內雌激素受體激活后反式激活IGF-1 受體，再依次激活ERK、MAPK、CREB 信號分子，而挽救全腦缺血誘發的海馬CA1區瀕臨死亡的神經元，減輕缺血所致的認知功能缺損。然而，IGF-1 在永久性局灶性腦缺血中是否也能通過MEK/ERK/CREB信號通路發揮其促存活作用?本研究結果發現大鼠永久性局灶性腦缺血48 h 同側皮質內IGF-1 表達下降，p-MEK 和p-ERK 也減少，MEK 和ERK 的活性受到抑制，繼而下調了下游轉錄因子CREB 的表達，實驗證實了IGF-1 在永久性局灶性腦缺血中作用的發揮不僅能夠通過PI3K/Akt 等信號通路介導，也能通過MEK/ERK/CREB 信號通路介導。

綜上所述，永久局灶腦缺血早期大鼠皮質內IGF-1 的表達下調，通過負調控MEK/ERK/CREB 促存活信號通路，間接加重了腦缺血性損傷。

［1］Rai VK，Bhatia R，Prasad K，et al.Long-term outcome of decompressive hemicraniectomy in patients with malignant middlecerebral artery infarction:a prospective observational study［J］.Neurol India，2014，62(1):26-31.

［2］Han Q，Liu S，Li Z，et al.DCPIB，a potent volume-regulated anion channel antagonist，Attenuates microglia-mediated inflammatory response and neuronal injury following focal cerebral ischemia［J］.Brain Res，2014，1542:176-185.

［3］Ma S，Zhong D，Chen H，et al.The immunomodulatory effect of bone marrow stromal cells (BMSCs)on interleukin (IL)-23/IL-17-mediated ischemic stroke in mice［J］.J Neuroimmunol，2013，257(1～2):28-35.

［4］Jia D，Han B，Yang S，et al.Anemonin alleviates nerve injury after cerebral ischemia and reperfusion (I/R)in rats by improving antioxidant activities and inhibiting apoptosis pathway［J］.J Mol Neurosci，2014，53(2):271-279.

［5］Javeri S，Rodi M，Tary-Lehmann M，et al.Involvement of brain-derived neurotrophic factor (BDNF)in MP4-induced autoimmune encephalomyelitis［J］.Clin Immunol，2010，137(2):181-189.

［6］He X，Li Y，Lu H，et al.Netrin-1 overexpression promotes white matter repairing and remodeling after focal cerebral ischemia in mice［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2013，33(12):1921-1927.

［7］Hu M，Zhang X，Liu W，et al.Longitudinal changes of defensive and offensive factors in focal cerebral ischemia-reperfusion in rats［J］.Brain Res Bull，2009，79(6):371-375.

［8］Gao H，Liu Y，Lu S，et al.Alteration of insulin-like growth factor-1 expression after middle cerebral artery occlusion in monkeys and rats:complementary DNA microarray，immunohistochemistry，and in situ hybridization studies［J］.J Stroke Cerebrovasc Dis，2006，15(4):158-163.

［9］Wang J，Tang Y，Zhang W，et al.Insulin-like growth factor-1 secreted by brain microvascular endothelial cells attenuates neuron injury upon ischemia［J］.FEBS J，2013，280(15):3658-3668.

［10］Zhu W，Fan Y，Hao Q，et al.Postischemic IGF-1 gene transfer promotes neurovascular regeneration after experimental stroke［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2009，29(9):1528-1537.

［11］Wang Y，Zhang Y，Huang J，et al.Increase of circulating miR-223 and insulin-like growth factor-1 is associated with the pathogenesis of acute ischemic stroke in patients［J］.BMC Neurol，2014，14:77-84.

［12］Sun C，Meng Q，Zhang L，et al.Glutamate attenuates IGF-1 receptor tyrosine phosphorylation in mouse brain:possible significance in ischemic brain damage［J］.Neurosci Res，2012，74(3～4):290-297.

［13］Sun X，Yao H，Douglas RM，et al.Insulin/PI3K signaling protects dentate neurons from oxygen-glucose deprivation in organotypic slice cultures［J］.J Neurochem，2010，112(2):377-388.

［14］Kim B，Sullivan KA，Backus C，et al.Cortical neurons develop insulin resistance and blunted Akt signaling:a potential mechanism contributing to enhanced ischemic injury in diabetes［J］.Antioxid Redox Signal，2011，14(10):1829-1839.

［15］Kim DH，Lee HE，Kwon KJ，et al.Early immature neuronal death initiates cerebral ischemia-induced neurogenesis in the dentate gyrus［J］.Neuroscience，2015，284:42-54.

［16］Kalluri HS，Dempsey RJ.IGFBP-3 inhibits the proliferation of neural progenitor cells［J］.Neurochem Res，2011，36(3):406-411.

［17］Lebesgue D，Chevaleyre V，Zukin RS，et al.Estradiol rescues neurons from global ischemia-induced cell death:multiple cellular pathways of neuroprotection［J］.Steroids，2009，74(7):555-561.

［18］Zheng YQ，Li L，Liu JX，et al.Study on effect of huatuo zaizao extractum on focal cerebral ischemia/reperfusion neurogenesis in rats and its mechanisms［J］.Zhongguo Zhong Yao Za Zhi，2014，39(5):891-895.