雙向凝膠電泳聯合MALDI-TOF/TOF MS技術探尋狼瘡性腎炎的血清標志物

許嶸　朱加明　龔劭敏　盧澤軍　張慧　劉少鵬　丁小強　鐘一紅

(1. 南京中醫藥大學附屬醫院江蘇省中醫院腎內科，江蘇南京　210029；

2. 復旦大學附屬中山醫院腎內科，上海　200032)

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·論著·

雙向凝膠電泳聯合MALDI-TOF/TOF MS技術探尋狼瘡性腎炎的血清標志物

許嶸1朱加明2龔劭敏2盧澤軍2張慧2劉少鵬2丁小強2鐘一紅2

(1. 南京中醫藥大學附屬醫院江蘇省中醫院腎內科，江蘇南京210029；

2. 復旦大學附屬中山醫院腎內科，上海200032)

摘要目的：通過雙向凝膠電泳與基質輔助激光解吸電離串聯飛行時間質譜(MALDI-TOF/TOF MS)技術初步探尋狼瘡性腎炎(LN)患者潛在的血清分子標志物，為闡明LN的發病機制奠定基礎。方法： 將40例LN患者分為活動組和緩解組，每組20例；另選擇IgA腎病患者和健康志愿者各20例，分別作為IgAN組和健康對照組。采用雙向凝膠電泳技術分離血清蛋白質，并采用MALDI-TOF/TOF MS鑒定差異表達的蛋白質。結果：共發現50個差異表達蛋白質。與健康對照組相比，LN活動組和LN緩解組共發現23個差異表達的蛋白質，上調8個、下調15個；與IgAN組相比，LN活動組和LN緩解組共發現18個差異表達的蛋白質，上調13個，下調5個；與LN緩解組相比，LN活動組表達上調和下調的蛋白質分別為4個和5個。在鑒定出的50個差異表達蛋白中，血清淀粉樣蛋白A(SAA)在LN活動組中的表達高于其他組，complement component C4A在LN活動組中的表達低于其他組；chain B(solution structure of double super helix model)在LN緩解組的表達高于其他組；與健康對照組相比，vitamin D-binding protein isoform 1 precursor、chain A(crystal structure of uncomplexed vitamin D-binding protein)和chain B(a covalent dimer of transthyretin that affects the amyloid Pathway)等在LN活動組和LN緩解組的表達均上調，而vitronectin precursor、ficolin-2 isoform a precursor和chain A(crystal structure of the catalytic domain of human complement C1s protease)則相反；與IgAN組相比，lipoprotein CIII 和vitronectin precursor在LN活動組和LN緩解組的表達均上調。結論：雙向凝膠電泳與MALDI-TOF/TOF MS聯用技術有效實現了對LN患者血清差異表達蛋白質的篩選與鑒定。這些差異表達的蛋白質可作為生物標志物用于LN的無創性診斷和評估，對這些蛋白質的進一步研究將有助于更好地了解LN的發病機制。

關鍵詞系統性紅斑狼瘡；狼瘡性腎炎；蛋白質組學；質譜；生物標志物

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種以免疫調節異常為特征、病變累及全身多系統多臟器的自身免疫性疾病。SLE的臨床表現復雜多樣?，F有的實驗室檢測指標，無論是特異性還是敏感性，都難以滿足臨床早期診斷和病情評估的需要。絕大多數SLE患者有不同程度的腎臟病變，其中狼瘡性腎炎(lupus nephritis, LN)是SLE最嚴重的并發癥之一。腎活檢是診斷和評估LN的可靠手段，但為有創檢查，在臨床廣泛開展受到一定限制。因此，尋找早期診斷和評估LN的無創性方法十分必要。蛋白質組學是后基因組時代生物學研究的新方向。Zhang 等[1]應用蛋白質組學方法，從LN患者的尿液標本中找到了一些可以預測疾病復發的標志物。胡成效等[2]應用該技術獲得了SLE患者外周血單個核細胞的蛋白質組差異表達圖譜。本研究聯合應用雙向凝膠電泳與基質輔助激光解吸電離串聯飛行時間質譜(MALDI-TOF/TOF MS)技術探尋LN無創性診斷和評估的潛在分子標志物，現報告如下。

1資料和方法

1.1一般資料本研究病例來自2011年6月—2012年2月在復旦大學附屬中山醫院腎內科就診的患者。依據美國風濕病學會(American College of Rheumatology，ACR)SLE診斷標準[3]和腎活檢病理檢查確診LN。將入組的40例LN患者按SLE疾病活動指數(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)[4]分為LN活動組(SLEDAI>9)和LN緩解組 (SLEDAI<5)，每組20例。LN活動組中，男性4例，女性16例，年齡18~69(39.75±14.20)歲；LN緩解組中，男性4例，女性16例，年齡14~65(31.25±13.92)歲。兩組患者性別構成和年齡差異無統計學意義(P>0.05)。另選擇性別、年齡相匹配的IgA腎病(IgA nephropathy, IgAN)患者和健康志愿者各20例，分別作為IgAN組和健康對照組。根據臨床表現和腎活檢診斷IgAN。IgAN組病理分級為Lee II~III級，尿蛋白定量1~3 g/24 h，腎功能正常，不伴惡性高血壓。

1.2試劑與設備丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、N,N,N,’N’-四甲基乙烯胺(TEMED)、考馬斯亮藍R-250、瓊脂糖、Tris、二硫蘇糖醇(DTT)、苯甲磺酰氟(PMSF)、3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸(CHAPS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、尿素、溴酚蘭購自美國Amresco公司；乙腈(ACN，高效液相色譜純化)購自德國Merck公司；三氟乙酸(TFA，高效液相色譜純化)、碘乙酰胺(IAA)、碳酸氫銨(NH4HCO3)、α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-CHCA)、胰蛋白酶、馬心肌紅蛋白購自美國Sigma公司；ProteoMiner高豐度蛋白質去除蛋白質濃縮試劑盒、固相pH 梯度膠條(pH 3~10 NL，18 cm )、兩性電解質 (Bio-Lyte)、等電聚焦儀、GS-800分子成像儀、PDQuest 圖像分析軟件均購自美國Bio-Rad公司；5800串聯飛行時間質譜儀(MALDI-TOF/TOF) 購自美國ABI公司。

1.3方法

1.3.1血清高豐度蛋白質的去除每例研究對象靜脈采血5 mL，分離血清。 同組血清混合后，每組取1 mL混合血清，按照ProteoMiner試劑盒說明書的操作步驟去除血清中高豐度蛋白質，經洗脫后用改進的Bradford法測定蛋白質濃度，分裝并保存于-80℃。

1.3.2雙向凝膠電泳按照美國Bio-Rad公司雙向凝膠電泳手冊和Gorg等方法進行操作，即第一向等電聚焦采用固相pH 梯度膠條(pH 3~10 NL，18 cm )，上樣量為250 μg(340 μL)，電壓48 kV；等電聚焦結束后，進行膠條平衡，隨后轉移至12%的非梯度膠上進行SDS-凝膠電泳分離。采用銀染法進行染色分析。

1.3.3圖像分析染色凝膠采用GS-800分子成像儀(美國Bio-Rad公司)掃描，獲取的圖像用PDQuest數據處理軟件(version 8.0, 美國Bio-Rad公司)進行強度校準、蛋白質點檢測、背景扣除、均一化和匹配等分析。蛋白質點的相對強度升高或降低3倍者被定義為差異表達蛋白質點，進行質譜鑒定。

1.3.4MALDI-TOF/TOF MS鑒定按膠內酶解方法進行蛋白質酶解，將完全干燥的提肽液重新溶解于α-CHCA溶液中，點樣于不銹鋼靶板，室溫下自然干燥。采用5800串聯飛行時間質譜儀進行分析，激光波長為337 nm，加速電壓為20 kV，脈沖寬度3 ns，離子延遲提取20 ns，采用正離子模式自動獲取數據。肽質量指紋譜(PMF)質量掃描范圍為700~3200 Da，對強度最大的6個峰進行串級質譜分析；PMF譜圖用馬心肌紅蛋白酶解肽段做外標校正。所得PMF及串級肽序列采用MASCOT 系統(英國Matrix Science公司)在NCBI數據庫檢索。

2結果

LN活動組與健康對照組的血清蛋白質表達差異見表1~5。

在50個差異表達的蛋白質中，某些蛋白質如血清淀粉樣蛋白A(SAA)在LN活動組中的表達高于其他組，complement component C4A在LN活動組中的表達低于其他組(圖1)；chain B(solution structure of double super helix model)在LN緩解組的表達高于其他組；與健康對照組相比，vitamin D-binding protein isoform 1 precursor、chain A(crystal structure of uncomplexed vitamin D-binding protein)和chain B(a covalent dimer of transthyretin that affects the amyloid pathway)等在LN活動組和LN緩解組均表達上調，而vitronectin precursor、ficolin-2 isoform a precursor和chain A(crystal structure of the catalytic domain of human complement C1s protease)則相反。與IgAN組相比，lipoprotein CIII 和vitronectin precursor在LN活動組和LN緩解組的表達均上調。見圖2。

表1　LN活動組與健康對照組相比有顯著表達差異的蛋白質

表2　LN緩解組與健康對照組相比有顯著表達差異的蛋白質

表3　LN活動組與IgAN組相比有顯著表達差異的蛋白質

表4　LN緩解組與IgAN組相比有顯著表達差異的蛋白質

表5　LN活動組與緩解組相比有顯著表達差異的蛋白質

圖1　SAA胰蛋白酶解肽段一級質譜圖

a： LN活動組；b： LN緩解組；c： 健康對照組；d： IgAN組

1： SAA; 2： vitamin D-binding protein isoform 1 precursor; 3： chain A: crystal structure of uncomplexed vitamin D-binding protein; 4: chain B, a covalent dimer of transthyretin that affects the amyloid pathway; 5: vitronectin precursor; 6: ficolin-2 isoform a precursor; 7: chain A, crystal structure of the catalytic domain of human complement C1s protease; 8: lipoprotein CIII; 9: vitronectin precursor; 10: chain B, solution structure of double super helix model apolipoprotein A-IV, Apo A-IV

圖2各組血清蛋白的雙向電泳圖譜(硝酸銀染色)

3討論

SLE是一種慢性自身免疫性疾病，可累及多個系統，但以腎臟受累最為常見。LN是SLE最嚴重的并發癥之一，臨床表現不一，可為無癥狀性蛋白尿，也可為急進性新月體腎炎[5]。LN是一種反復發作和緩解交替的慢性病。腎活檢病理檢查是診斷LN和評估病情的“金標準”，但腎活檢畢竟是有創傷性檢查，有些患者因病情較重而不能耐受，故臨床應用受到限制。尋找無創性檢查指標，對指導LN的診斷和病情評估意義重大。MALDI-TOF/TOF MS是目前較常用的高通量蛋白質鑒定方法[6-7]，可快速獲得高靈敏度的多肽質量指紋圖和多肽序列信息，有較高的蛋白質鑒定成功率。

本研究共獲得50個在不同組間差異表達的蛋白質。與健康對照組相比，LN活動組和緩解組出現差異表達的蛋白分別為12個和11個，其中vitamin D-binding protein isoform 1 precursor、chain A(crystal structure of uncomplexed vitamin D-bin-ding protein)和chain B(a covalent dimer of trans-thyretin that affects the amyloid pathway)等在LN活動組和LN緩解組都表達上調，而ficolin-2 isoform a precursor、chain A(crystal structure of the catalytic domain of human complement C1s protease)和vitronectin precursor則相反。這些蛋白質分子可能參與了LN的發病過程。與IgAN組相比，LN活動組和緩解組分別有5個和8個蛋白表達顯著上調，2個和3個蛋白表達顯著下調，其中lipoprotein CIII 和vitronectin precursor在LN活動組和LN緩解組的表達均上調，對這些蛋白做進一步研究不僅有助于LN和IgAN的鑒別診斷，還可能有助于闡明原發性腎小球腎炎和繼發性腎小球腎炎發病機制的差異。與LN緩解組相比，LN活動組有4個蛋白表達顯著上調，5個蛋白表達顯著下調，這些蛋白可能參與了LN的復發或緩解。對其進行進一步驗證分析，有望篩選出用于評估LN的活動程度和指導治療的新指標。

SAA主要功能有：參與脂類代謝和轉運、刺激促炎性細胞因子生成和趨化炎性細胞等。SAA在機體發生細菌或真菌感染、腫瘤、類風濕性關節炎和血管炎時可顯著升高(100~1000 mg/L)，在發生病毒感染或SLE時常為輕度升高(10~100 mg/L)。我們的研究結果顯示，LN活動組SAA的表達顯著高于健康對照組、IgAN組和LN緩解組，說明SAA可能參與了LN的發病過程，因此可能成為LN病情活動度的評估指標。

本研究中，Apo A-IV在LN緩解組的表達顯著高于LN活動組和IgAN組，說明Apo A-IV可能通過增加表達來加強其抗炎作用從而促進LN病情的緩解。

本研究利用MALDI-TOF/TOF MS對LN患者血清差異表達蛋白質進行鑒定，共獲得50個在各組間差異表達的蛋白質。對這些蛋白質做進一步功能研究和臨床驗證，有可能為LN的診斷、治療和病情評估提供新的線索和依據。

參考文獻

[1]Zhang X, Jin M, Wu H, et al. Biomarkers of lupus nephritis determined by serial urine proteomics[J]. Kidney Int, 2008,74(6):799-807.

[2]胡成效,戴勇,劉建軍,等.系統性紅斑狼瘡患者外周血單個核細胞蛋白質組學研究[J].中華風濕病學雜志,2009,13(11)：779-782.

[3]Tan EM, Cohen AS, Fries JF, et al. The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus[J]. Arthritis Rheum, 1982, 25(11):1271-1277.

[4]Gladman DD, Ibanez D, Urowitz MB. Systemic lupus erythematosus disease activity index 2000[J]. J Rheumatol, 2002, 29(2):288-291.

[5]王鴻利. 實驗診斷學[M]．北京：人民衛生出版社，2006：325．

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Exploring Serum Protein Biomarkers of Lupus Nephritis by Using Two-Dimensional Gel Electrophoresis Combined with Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry

XURong1ZHUJiaming2GONGShaomin2LUZejun2ZHANGHui2LIUShaopeng2DINGXiaoqiang2ZHONGYihong2

1.DepartmentofNephrology,JiangsuProvinceHospitalofTraditionalChineseMedicine,NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210029,China; 2.DepartmentofNephrology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective：To explore the potential serum biomarkers of patients with lupus nephritis(LN) by using two-dimensional electrophoresis combined with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF/TOF MS), so as to lay the foundation for illuminating pathogenesis. Methods:A total of 40 LN patients were divided into two groups, the active LN group and the inactive LN group, with 20 in each. In addition, 20 IgA nephritis patients and 20 healthy volunteers were enrolled as IgAN group and healthy control group. Two-dimensional gel electrophoresis was used to separate and analyze the serum proteins, and MALDI-TOF/TOF MS was applied to the identification of the differentially expressed proteins. Results: A total of fifty differentially expressed proteins were identified. Compared with that in healthy control group, 23 differentially expressed proteins were discovered in active LN group and inactive LN group, among which, 8 proteins were up-regulated and 15 proteins were down-regulated. And 18 differentially expressed proteins, compared with IgA nephritis group, were found in active LN group and inactive LN group, including 13 up-regulated proteins and 5 down-regulated proteins. Furthermore, the number of up-regulated and down-regulated proteins in active LN group, compared with those in inactive LN group, were 4 and 5, respectively. Among the 50 identified differentially expressed proteins, the expression of serum amyloid protein A( SAA ) in active LN group was higher than that in the other groups while the expression of complement component C4A in active LN group was lower than that in the other groups. And the expression of chain B (solution structure of double super helix model) in the inactive LN group was higher than that in the other groups. Compared with that in healthy control group, the expression of vitamin D-binding protein isoform 1 precursor, chain A(crystal structure of uncomplexed vitamin D-binding protein) and chain B (a covalent dimer of transthyretin that affects the amyloid pathway) was up-regulated in both active LN group and inactive LN group, while the expression of the vitronectin precursor, ficolin-2 isoform a precursor and chain A (crystal structure of the catalytic domain of human complement C1s protease) was down-regulated. Compared with that in IgA nephritis group, the expression of lipoprotein CIII and vitronectin precursor was up-regulated in both active LN group and inactive LN group. Conclusions: Combination of two-dimensional gel electrophoresis and MALDI-TOF/TOF MS is effective for screening and identification of differentially expressed proteins in serum from LN patients. These differentially expressed proteins could be used as biomarkers for noninvasive diagnosis and evaluation of LN. Further study on these proteins would be conducive to understanding the pathogenesis of LN.

Key WordsSystemic lupus erythematosus;Lupus nephritis;Proteomics;Mass spectrometry;Biomarkers

通訊作者鐘一紅，E-mail：jennyzhong@msn.com

基金項目：上海市科委基礎研究重點項目(編號：08JC1404300)

中圖分類號R692

文獻標識碼A