免疫組織化學和聚合酶鏈反應在乳腺癌易患基因檢測中的應用價值

王振威,吳　靜,張占東,袁　媛

(1.唐山市婦幼保健院普外科，河北 唐山 063000; 2.唐山市眼科醫院內科，河北 唐山 063000)

免疫組織化學和聚合酶鏈反應在乳腺癌易患基因檢測中的應用價值

王振威1※,吳靜2,張占東1,袁媛1

(1.唐山市婦幼保健院普外科，河北 唐山 063000; 2.唐山市眼科醫院內科，河北 唐山 063000)

摘要：目的探討免疫組織化學和聚合酶鏈反應(PCR)在檢測乳腺癌易患基因中的應用價值。方法選取2013年10月至2014年10月唐山市婦幼保健院診治的乳腺癌患者37例為乳腺癌組，良性乳腺疾病患者37例為良性乳腺疾病組，健康體檢者37例為正常組，均行免疫組織化學和PCR檢測乳腺癌易患基因。結果乳腺癌組乳腺癌易患基因1、乳腺癌易患基因1/β2微球蛋白分別為(1.13±0.51)×105拷貝/L、(0.37±0.12)，均低于正常組[(3.09±1.38)×105拷貝/L、(0.95±0.36)]和良性乳腺疾病組[(2.87±1.40)×105拷貝/L、(0.93±0.41)]，差異均有統計學意義(P<0.05)。乳腺癌組乳腺癌易患基因人表皮因子受體2(Her2)、細胞角蛋白5/6(CK5/6)、表皮生長因子受體(EGFR)分別為(6.75±2.98)×109拷貝/L、(25.84±11.43)×108拷貝/L、(43.54±18.26)×107拷貝/L，均顯著高于正常組[(3.65±1.40)×109拷貝/L、(2.69±0.54)×108拷貝/L、(2.18±0.90)×107拷貝/L]和良性乳腺疾病組[(3.80±1.31)×109拷貝/L、(2.76±0.68)×108拷貝/L、(2.27±1.04)×107拷貝/L]，差異均有統計學意義(P<0.05)。乳腺癌組β2微球蛋白低于正常組和良性乳腺疾病組。行Her2檢測時，PCR檢測的靈敏度、特異度、準確度均高于免疫組織化學檢測。結論免疫組織化學和PCR檢測均可用于乳腺癌易患基因的診斷，其中PCR檢測的靈敏度、特異度、準確度更高。

關鍵詞：乳腺癌；免疫組織化學；聚合酶鏈反應；易患基因；評估

乳腺癌是臨床常見病癥，也是女性最為常見的惡性腫瘤疾病，具有較高的發病率[1-2]，直接影響著患者的預后狀況。近年來，乳腺癌易患基因1、人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，Her2)、細胞角蛋白5/6(cytokeratin 5/6，CK5/6)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)逐漸成為了研究熱點，為乳腺癌患者的治療與預后提供了重要的科學依據[3-4]。目前，臨床檢測乳腺癌易患基因的方法有很多，其中免疫組織化學和聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)檢測較為常用[5-6]。為了探討免疫組織化學和PCR檢測乳腺癌易患基因在乳腺癌療效的評估效果，本研究采用免疫組織化學和PCR檢測乳腺癌易患基因，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選取2013年10月至2014年10月唐山市婦幼保健院診治的乳腺癌患者37例為乳腺癌組，均符合《中國常見惡性腫瘤診治規范》的診斷標準[7]，經臨床表現、實驗室檢測、影像學檢查、病理組織學檢查確診，排除患有器質性疾病、血液性疾病、免疫性疾病、感染性疾病、精神疾病的患者。患者年齡 27～62歲，平均(41.6±5.1)歲，體質量39～72 kg，平均(49.2±3.9) kg。良性乳腺疾病患者37例為良性乳腺疾病組，年齡25～63歲，平均(40.9±5.5)歲，體質量38～74 kg，平均(49.1±3.4) kg。健康體檢人員37例為正常組，年齡24～65歲，平均(41.2±5.6)歲，體質量40～71 kg，平均(49.1±3.6) kg。三組年齡、體質量等比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究已取得患者及家屬同意，簽訂患者知情同意書，經醫院倫理委員會通過。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學檢測將病理標本取材后，經4%甲醛固定，然后組織脫水，進行石蠟包埋，實施蘇木精染色和彈力纖維染色，最后免疫組織化學染色。此次研究的標志物為β2微球蛋白、乳腺癌易患基因1、Her2、CK5/6、EGFR，在光學顯微鏡下進行觀察，抗體表達于細胞核、細胞質、細胞膜，如果出現黃色或棕黃色顆粒，可認定為陽性細胞，同一切片內陽性細胞數所占同類細胞術10%以上，可認定為結果陽性[4]。

1.2.2PCR檢測首先要提取組織RNA，將組織放入液氮中進行研磨，變成粉末后，將50 g組織置入Trizol 1 mL裂解，在室溫下靜置5 min，加入氯仿200 μL，劇烈震蕩15 s，充分混合，室溫下靜置5 min，4 ℃下離心15 min，轉速12 000 r/min，離心半徑12 cm。將離心后混合物分三相，上層水相移至1.5 mL離心管中，按異丙醇0.5 mL/Trizol 1 mL加入異丙醇，充分混勻，室溫下靜置10 min，4 ℃下離心10 min，轉速12 000 r/min。RNA會在離心管底部和側面形成白色沉淀，去上清，按1∶1比例加入75%乙醇，充分混勻，4 ℃下離心5 min，轉速10 600 r/min。去上清，在室溫下靜置10 min，讓RNA沉淀干燥，然后加入焦碳酸二乙酯水溶解，測定核酸濃度時波長260 nm，測定蛋白質濃度時波長280 nm，核酸/蛋白質比值為1.8～2.1，可認定為RNA提取成功，將其逆轉錄為單鏈DNA。

1.2.3逆轉錄操作步驟取滅菌、無核酸酶0.2 mLPCR反應管，依次加入總RNA、Oligo dT Primer 0.5 μL、5×PrimeScript Buffer(for Real Time)2 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，焦碳酸二乙酯水定容到20 μL，以轉速2000 r/min離心30 s，擴增條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

1.2.4PCR擴增操作步驟取0.2 mLPCR反應管，在冰上依次加入2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上下游引物、單鏈DNA各1 μL，超純水加至25 μL，以轉速2000 r/min離心30 s。上機擴增，94 ℃預變性3 min，循環1次，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環，總延伸72 ℃ 2 min，將產物用于瓊脂糖凝膠電泳。PCR引物及試劑盒均購自于美國應用生物系統公司。

1.2.5瓊脂糖凝膠電泳操作步驟制備1%瓊脂糖凝膠備用。取1 μL預染液Gel-dye和PCR產物充分混合，加樣，恒壓電泳，每隔10 min在紫外燈投射下觀察，40 min后在凝膠電泳成像系統下觀察，記錄結果。

結果認定：根據標準曲線，儀器可自動計算拷貝數，將人工合成的標準品稀釋10倍，觀察相關系數的改變，設定確定線性范圍在105～109拷貝/L為正常范圍，低于正常范圍為陽性[3]。

2結果

2.1各組乳腺癌易患基因1與β2微球蛋白表達比較 乳腺癌組乳腺癌易患基因1、乳腺癌易患基因1/β2微球蛋白均低于正常組和良性乳腺疾病組，差異均有統計學意義(P<0.05)，三組β2微球蛋白水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　各組乳腺癌易患基因1與β2微球蛋白表達比較　±s)

正常組：健康體檢者；a與正常組比較，P<0.05；b與良性乳腺癌疾病比較，P<0.05

2.2各組乳腺癌易患基因Her2、CK5/6、EGFR表達比較 兩組乳腺癌易患基因Her2、CK5/6、EGFR比較差異均無統計學意義(P>0.05)。乳腺癌組乳腺癌易患基因Her2、CK5/6、EGFR均明顯高于正常組和良性乳腺疾病組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2　各組乳腺癌易患基因Her2、CK5/6、EGFR表達比較　

Her2:人表皮因子受體2;CK5/6:細胞角蛋白5/6;EGFR:表皮生長因子受體; 正常組：健康體檢者；a與正常組比較,P<0.05;b與良性乳腺疾病組比較,P<0.05

2.3乳腺癌組乳腺癌易患基因陽性表達比較 PCR檢測的乳腺癌易患基因1陽性率、CK5/6陽性率、EGFR陽性率均明顯高于免疫組織化學檢測，差異均有統計學意義(P<0.05)。兩組Her2陽性率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3　乳腺癌組患者乳腺癌易患基因陽性表達比較　[例(%)]

PCR：聚合酶鏈反應；Her2:人表皮因子受體2;CK5/6:細胞角蛋白5/6;EGFR:表皮生長因子受體

2.4免疫組織化學和PCR檢測的靈敏度、特異度、準確度比較 行乳腺癌易患基因1、CK5/6、EGFR檢測時，PCR檢測的靈敏度、特異度、準確度均明顯高于免疫組織化學檢測。行Her2檢測時，PCR檢測的靈敏度、特異度、準確度均高于免疫組織化學檢測。見表4。

3討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發病率占全身各種惡性腫瘤的7%～10%[8-9]，在婦女僅次于子宮癌，已成為威脅婦女健康的主要病因。乳腺癌的病因尚未完全清楚，但患者存在乳腺癌易患基因1、Her2、CK5/6、EGFR，在疾病的進展過程中出現了改變，分析如下。①乳腺癌易患基因1。乳腺癌易患基因1是一種常見的人乳腺癌易患基因，定位于染色體17q21D17s1321～D17s1325，屬于抑癌基因，在抑制細胞生長、細胞周期調控、基因轉錄調節、DNA損傷修復及凋亡中發揮著重要的作用，不僅參與了細胞活動，還能有效維持基因穩定性。通常情況下，乳腺癌易患基因1在正常組織中表達水平相對高，是因為腫瘤組織低表達而造成的，其實為正常表達水平。研究表明，乳腺癌易患基因1與乳腺癌早期發生、發展、轉移密切相關[10-11]。②Her2。Her2是迄今為止乳腺癌中研究較為透徹的基因之一，基因的過表達不僅與腫瘤的發生發展相關外，還是一個重要的臨床治療監測及預后指標，并且是腫瘤靶向治療藥物選擇的一個重要靶點，與乳腺癌的發生、發展密切相關[12-13]，其擴增和過表達患者的復發轉移早，無病生存期較短，預后效果較差，對臨床治療與預后評估的意義重大。③CK5/6。CK5/6是一種上皮特異性標志物，是上皮源性腫瘤細胞骨架的組成成分，屬于多基因家族之一，其成員超過30種，在上皮性腫瘤組織中具有較高水平的表達，尤其是乳腺癌[14-15]。由于CK5/6具有高度的上皮組織特異性，在乳腺癌細胞中呈廣泛表達，因而CK5/6可作為檢測乳腺癌患者腫瘤細胞的一個有效指標。④EGFR。EGFR是原癌基因c-erbB1的表達產物，是EGFR家族成員之一,在細胞生理過程中發揮重要的調節作用。EGFR廣泛分布于上皮細胞、成纖維細胞、膠質細胞、角質細胞等細胞表面，其信號通路對細胞的生長、增殖和分化等生理過程發揮重要的作用。EGFR過表達可造成腫瘤細胞增殖、血管生成、促進轉移、抑制凋亡，進而惡化患者病情，影響患者的預后[16-17]。

表4　免疫組織化學和PCR檢測的靈敏度、特異度、準確度比較　(%)

PCR：聚合酶鏈反應；Her2:人表皮因子受體2;CK5/6:細胞角蛋白5/6;EGFR:表皮生長因子受體

本研究結果顯示，乳腺癌組乳腺癌易患基因1、乳腺癌易患基因1/β2微球蛋白均顯著低于正常組和良性乳腺疾病組，說明乳腺癌患者體內乳腺癌易患基因1降低幅度很大，與疾病的嚴重程度密切相關。乳腺癌組乳腺癌易患基因Her2、CK5/6、EGFR均顯著高于正常組和良性乳腺疾病組，說明乳腺癌患者體內乳腺癌易患基因Her2、CK5/6、EGFR均出現了過表達現象，這與上述分析結果一致。

目前，臨床檢測乳腺癌易患基因的方法有很多，其中免疫組織化學和PCR檢測較為常用。免疫組織化學利用了免疫學基本原理抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內抗原(多肽和蛋白質)，對其進行定位、定性及定量的研究方法，也可稱為免疫組織化學技術或免疫細胞化學技術。免疫組織化學操作簡單，可行性高，結果讀取方便，耗時較少，費用較低，適用于臨床大批量檢測，但容易受到組織標本處理和觀察者主觀判斷的影響，可造成結果偏差。

PCR還可稱為無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術，是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火(復性)及適溫延伸等幾步反應組成一個周期，循環進行，使目的DNA得以迅速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。

本研究結果顯示，PCR檢測的乳腺癌易患基因1陽性率、CK5/6陽性率、EGFR陽性率均明顯高于免疫組織化學檢測，說明PCR檢測的陽性檢出率更高。行乳腺癌易患基因1、CK5/6、EGFR檢測時，PCR檢測的靈敏度、特異度、準確度均明顯高于免疫組織化學檢測，說明PCR檢測的應用價值更高，結果更加真實可靠。兩種檢測方法的檢測結果具有較高的一致性。

綜上所述，免疫組織化學和PCR檢測乳腺癌易患基因均可用于乳腺癌評價，其中PCR檢測的靈敏度、特異度、準確度更高。但本研究也存在一定的弊端，樣本量較少，仍需要進一步擴大，沒有進行動態觀察，需要進一步研究探討。

參考文獻

[1]馬駿,傅繼華.生活方式與乳腺癌發病相關性的研究進展[J].中華腫瘤防治雜志,2012,19(5):397-400.

[2]柳曉義,曹偉紅,王宇,等.ApoA1基因多態性與乳腺癌發病相關性的研究[J].中華腫瘤防治雜志,2011,18(19):1506-

1509.

[3]鄧君,孫昌瑞,饒紹琴,等.兩種方法檢測乳腺癌易感基因1表達水平在乳腺癌診斷中的應用[J].實用醫院臨床雜志,2014,11(6):102-104.

[4]陳穎,李睿,劉源,等.免疫組化和PCR檢測乳腺癌Her-2、EGFRt 和CK5/6過表達水平用于乳腺癌療效的評估[J].哈爾濱醫科大學學報,2013,47(1):56-59.

[5]宋小川,謝小軍,任宏,等.乳腺癌免疫組化檢測在乳腺癌患者診治中的意義分析[J].現代生物醫學進展,2013,13(29):5694-5696.

[6]劉華慶,匡曉燕.雙重免疫組化技術檢測乳腺癌STAT5和ER相關表達的意義[J].第三軍醫大學學報,2011,33(11):1199-1201.

[7]中國癌癥防治辦公室,中國抗癌協會.中國常見惡性腫瘤診治規范[M].北京:北京醫科大學,中國協和醫科大學聯合出版社,1990:10.

[8]蒙彥軍.乳腺癌發病現況的研究進展[J].中國藥物經濟學,2013,3(1):440-441.

[9]徐雅莉,孫強,單廣良,等.中國女性乳腺癌發病相關危險因素:病例對照研究[J].協和醫學雜志,2011,2(1):7-14.

[10]南潤玲,尚培中,王曉倩.乳腺癌患者血清中乳腺癌易感基因1和細胞角蛋白19的含量及意義[J].廣東醫學,2012,33(17):2645-2647.

[11]孫昌瑞,鄧君,江詠梅.聯合檢測乳腺癌易感基因1與Ccnd1mRNA 在乳腺癌診斷中的應用研究[J].實用醫院臨床雜志,2014,11(6):67-69.

[12]姚國棟,侯明星,袁宏偉,等.熒光原位雜交與免疫組化法檢測乳腺癌HER-2表達的臨床意義[J].腫瘤學雜志,2012,18(4):306-308.

[13]趙艷姣,劉新蘭,秦璟.FISH及免疫組化技術檢測乳腺癌Her-2基因與蛋白的臨床應用價值[J].寧夏醫學雜志,2013,35 (7):586-588.

[14]譚敏華,雷偉華,譚冬玲,等.浸潤性乳腺癌ER、PR、HER-2、E-cadherin、CK5/6檢測與臨床預后關系[J].臨床與實驗病理學雜志,2011,27(9):933-938.

[15]畢曉峰,郝佳潔,徐昕,等.乳腺癌組織CK5/6的表達及與預后關系的研究[J].中華腫瘤防治雜志,2014,21(12):925-929.

[16]徐謙,藍天,王曉稼.EGFR表達與三陰性乳腺癌靶向治療的相關性[J].中國腫瘤,2012,21(4):281-284.

[17]湯永峰,謝莉莉,馮曉敏,等.PTEN、p53和EGFR在乳腺癌中的表達與臨床意義[J].現代腫瘤醫學,2014,22(2):345-349.

Evaluation of Immunohistochemistry and PCR in Test of Susceptible Gene ofBreast Cancer

WANGZhen-wei1,WUJing2,ZHANGZhan-dong1,YUANYuan1.

(1.DepartmentofGeneralSurgery,TangshanMaternalandChildHealthCareHospital,Tangshan063000,China; 2.DepartmentofInternalMedicine,TangshanOphthalmologyHospital,Tangshan063000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the application value of immunohistochemistryand polymerase chain reaction(PCR) in breast cancer susceptibility gene detection.MethodsTotal of 37 patients with breast cancer were selected in Tangshan Maternal and Child Health Care Hospital from Oct.2013 to Oct.2014 were included as breast cancer group,37 patients with benign breast disease were included as benign breast disease group,and 37 healthy persons as normal group.All people received breast cancer susceptibility gene detection of immunohistochemistry and PCR.ResultsBreast cancer susceptibility gene 1,breast cancer susceptibility gene 1/β2microglobulin in the breast cancer group were (1.13±0.51)×105copies/L,(0.37±0.12),both lower than the control group [(3.09±1.38)×105copies/L,(0.95±0.36)] and benign breast disease group [(2.87±1.40)×105copies/L,(0.93±0.41)],the differences were statistically significant(P<0.05).Breast cancer susceptibility genes human epidermal growth factor receptor 2(Her2),cytokeratin 5/6(CK5/6),epidermal growth factor receptor(EGFR) in breast cancer group were (6.75±2.98)×109copies/L,(25.84±11.43)×108copies/L,(43.54±18.26)×107copies/L respectively,significantly higher than the normal group [(3.65±1.40)×109copies /L,(2.69±0.54)×108copies/L,(2.18±0.90)×107copies/L] and benign breast disease group [(3.80±1.31)×109copies/L,(2.76±0.68)×108copies/L,(2.27±1.04)×107copies/L],the differences were statistically significant(P<0.05).β2microglobulin in breast cancer group was lower than the normal group and benign breast disease group.As for Her2 line detection,the sensitivity,specificity,and accuracy of PCR assay were higher than immunohistochemistry.ConclusionBoth immunohistochemistry and PCR can be used to for breast cancer susceptibility gene detection,and PCR detection has higher sensitivity,specificity,and accuracy.

Key words:Breast cancer; Immunohistochemistry; Polymerase chain reaction; Susceptibility gene; Evaluation

收稿日期：2015-06-08修回日期：2015-09-10編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.23.043

中圖分類號：R737;R446

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)23-4343-03