不同來源菌株固態發酵對紫麥麩皮酚酸釋放及抗氧化性能的影響

孫盈乾，張憲省，董海洲，侯漢學，張錦麗

(1山東農業大學食品科學與工程學院，山東泰安 271000;2山東農業大學生命科學院，山東泰安 271000)

生物活性物質能降低一些慢性疾病發生率，并且有抗氧化活性。因此對果蔬、農業工業廢渣中具有生物活性的酚類化合物的研究越來越深入。酚類結構可以減緩或阻止氧化反應的進行［1］。由于彩色小麥麩皮中的酚酸大多數與纖維素木糖以酯鍵或醚鍵的形式相連［2］，以結合態形式存在，可被酸堿或微生物分解［3-5］。I-Hsin Lee［6］等研究了絲狀真菌發酵黑豆，發酵黑豆的DPPH·清除能力、Fe2+螯合能力和還原能力均有所提高。Ming-Yen Juan［7］等選用枯草桿菌BCRC14715固態發酵黑豆，結果表明發酵提高了總酚和花青素含量、DPPH·清除能力、Fe2+螯合能力。K.Katina［8］等研究了酵母菌、乳酸菌及混合發酵對天然黑麥及發芽黑麥營養品質的影響，研究結果表明，發芽后用啤酒酵母發酵能顯著提高游離酚酸的含量。

目前國內外的相關研究已顯示出固態發酵小麥麩皮、秸稈、豆類等能提高抗氧化性能。為提高彩麥麩皮的抗氧化能力，本文采用已從麩皮中中分離出菌種，用固態發酵的方法提高紫麥麩皮中的游離酚類物質含量，以期找到能有效降解與多糖和木質素相連的酯鍵或醚鍵，釋放出游離的酚類物質的菌種，為微生物發酵麩皮及其在食品生產中的應用提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

由肥城富士康面粉廠不同來源的麩皮中篩選出的霉菌13 株。其中Ⅰ:取自放置于陰暗屋內尼龍袋中已發生自然霉變的麩皮;Ⅱ:取自背陰處墻角，有泥土處，散落的濕潤的麩皮;Ⅲ:取自水泥地路面處，自然堆積的麩皮;紫色小麥:濟南民天面粉有限公司。

1.1.2 試劑

木糖、三氯化鐵、地衣酚、DPPH、無水碳酸鈉、沒食子酸、乙醚、乙酸乙酯、正己烷、無水乙醇均為分析純。RP-HPLC 所用試劑為色譜純。

1.2 主要儀器與設備

M2e 多功能微孔板檢測儀 (USA，Molecular Devices);SHB 型循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司);DLSB-5 型低溫冷卻液循環泵(鄭州長城科工貿有限公司);R-1001 旋轉蒸發器(鄭州長城科工貿有限公司);高效液相色譜儀(LC-20AT 高壓泵)，日本島津公司，島津色譜柱Inertsil ODS-SP (250 mm ×4.6 mm，5 μm)。

1.3 試驗方法

紫色小麥麩皮:紫色小麥→脫皮→粉碎→過篩(40 目)→滅菌(100℃，15min)。

1.3.1 麩皮的固態發酵

從斜面保藏培養基上挑取幾環孢子于無菌水中，調整細胞個數為106個/mL。稱取適量麩皮，加入菌浮液于適宜溫度下發酵。發酵后的紫麥麩皮樣品于50℃烘箱中干燥，磨碎。

1.3.2 總酚及酚酸的提取及測定

(1)總酚及酚酸的提取

總酚的提取。用80%的甲醇提取發酵后的紫麥麩皮，超聲輔助提取1h，離心。重復提取1 次。合并上清液，濃縮至無醇，用甲醇定容至10mL。

酚酸的提取。發酵后的紫麥麩皮中加入正己烷，超聲輔助脫脂1h，離心。重復脫脂1 次，用甲醇提取脫脂后的紫麥麩皮，合并上清液，濃縮至無醇，用鹽酸調節pH 為2，用等體積乙醚/乙酸乙酯萃取3 次，合并有機相于40 ℃濃縮干燥，色譜甲醇復溶后得游離型酚酸。

(2)總酚含量的測定

100μL 總酚溶液中加入6mL 蒸餾水，渦旋震蕩5s，靜置1～8min;加入1.5mL Na2CO3溶液，加蒸餾水定容到10mL。室溫避光條件下，將密封的試管靜置2h;765nm 下測定吸光度。以空白試劑做參比，沒食子酸為標準品，制作標準曲線。試驗確定回歸方程為y=0.116 8x－0.005 32，相關系數R2=0.997 5，其中x:沒食子酸濃度(μg/mL)。

(3)DPPH·清除率

取總酚溶液0.1mL 加3.9mL 6×10－5mol/L DPPH 溶液，室溫黑暗下反應60min。然后在517nm 處，測定0和60min 時的吸光度。

(4)酚酸組成

色譜條件:流動相為A—水/冰醋酸(0.5%，v/v);B—乙腈/冰醋酸(0.5%，v/v)。梯度洗脫為0～20 min，B 為10% ;20～30 min，B 為10%～50% ;30～40 min，B為50%～100% ;40～45min，B 為100%～10%。進樣量為20μL;進樣前酚酸溶液均用0.45μm 微孔濾膜過濾。定性定量方法為保留時間和最大吸收波長定性，外標法定量。

圖1 混合標準品的RP-HPLC 譜圖(280 nm)

將酚酸標準品按一定濃度溶于乙腈中，制得11 種標準品的混合標樣，進行高效液相色譜檢測，確定其保留時間及分離效果。所得標準品的液相色譜圖如圖1 所示。將11 種標準品按一定倍數稀釋，繪制標準曲線，所得到標準曲線的相關系數列于表1 中。

表1 11 種標準樣品的相關性系數

1.3.3 水溶性阿拉伯木聚糖的測定

取100mg 發酵后的紫麥麩皮，加入10mL 水，30℃振蕩2h，離心;取1mL 上清液，加入1mL 4 mol/L 的HCl，在密封的試管內100℃保持2h，冷卻;取1 mL 加入到試管，加入2mL 水，3mL FeCl3和0.3mL 地衣酚;沸水浴加熱30min，取出后加入蒸餾水到10mL，冷卻;670 nm 下測吸光度。以空白試劑做參比，木糖為標準品，制作標準曲線。試驗確定回歸方程為y=0.54x－0.002，相關系數R2=0.998，其中x:木糖濃度(mg/mL)。

1.3.4 數據統計分析

采用SPSS 18.0 統計軟件的單因素方差分析(ANOVA)和Duncan 多重比較法進行數據統計(α＜0.05)，所有測定重復3 次，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 霉菌發酵紫麥麩皮的總酚含量

Ⅱ-M1 對總酚含量的釋放效果較好(圖2)。由樣本Ⅱ篩選出的霉菌發酵紫麥麩皮后的總酚含量沒有顯著性差異。樣本Ⅰ篩選出的霉菌發酵紫麥麩皮后的總酚含量差異顯著。

霉菌固態發酵紫麥麩皮后的總酚含量增加，這一結果與Dordevic 等［9］、JEFFREYMOORE 等［10］的研究結果一致。紫色小麥麩皮中加入霉菌的菌懸液固態發酵，可以斷裂與酯類連接的酯鍵或醚鍵，使酚類物質由結合型變為游離型，含量增加。麩皮中加入霉菌，在發酵過程中會產生內源性的酶類，使麩皮的細胞壁發生降解，釋放出更多的酚類化合物。

圖2 霉菌發酵對紫麥麩皮總酚含量的影響

2.2 霉菌發酵紫麥麩皮的DPPH·清除率

由圖3 可以看出，Ⅱ-M1、Ⅲ-M6 固態發酵紫色小麥麩皮后的DPPH·清除率的增加較為顯著。Ⅱ、Ⅲ來源篩選出的霉菌固態發酵紫麥麩皮后的DPPH·清除率差異顯著。

圖3 霉菌發酵紫麥麩皮的DPPH·清除率

霉菌固態發酵紫色小麥麩皮后的DPPH·清除率均有一定程度的提高，霉菌最高增加了0.33 倍。紫麥麩皮中總酚含量與DPPH·清除率增加程度并不是一致的。DPPH·清除率大小可能是多種生物活性成分協同作用的結果，在發酵過程中，微生物作用于麩皮中，除了釋放出游離的酚酸外、還釋放出了類黃酮、木酚素等化合物，用FC 法測定出的是酚類化合物的含量，而DPPH·的清除并不是這些酚類化合物作用簡單加和的結果。研究表明，酚酸［11］和類黃酮［12］有一定的清除自由基的效果。

2.3 霉菌發酵紫麥的酚酸組成

由表1 可以看出，霉菌發酵紫麥麩皮后，麩皮中游離型酚酸以阿魏酸為主。異阿魏酸和水楊酸的含量次之，原兒茶酸和丁香酸均可檢測到，但是含量相對較低。部分菌株發酵后，沒有檢測到沒食子酸和對羥基苯甲酸。其中第Ⅱ-M1、Ⅲ-M5 株菌發酵后釋放出的酚酸含量相對較高，達到了2 600μg/g 麩皮以上。

固態發酵后釋放出的酚酸以阿魏酸為主約占酚酸總量的50%～91%，其次主要是對香豆酸、異阿魏酸，這說明固態發酵對羥基肉桂酸的衍生物的釋放效果較好。總的來說，肉桂酸類酚酸的含量高于苯甲酸類的酚酸。與丁巖［13］關于紫麥麩皮游離中酚酸組成的研究結果相比，發酵后阿魏酸的含量顯著提高，檢測到沒食子酸、異阿魏酸和水楊酸。

表2 霉菌發酵紫麥麩皮的游離酚酸組成(μg/g 脫脂麩皮)

2.4 霉菌發酵紫麥麩皮的可溶性阿拉伯木聚糖含量

由圖4 可以看出，霉菌發酵后可溶性阿拉伯木聚糖提取率一定程度的降低，這可能是因為霉菌在固態發酵過程中，能夠較大程度的以阿拉伯木聚糖作為碳源生長。

麩皮發酵過程中內部結構變的疏松，易于水溶性阿拉伯木聚糖的溶出。阿拉伯木聚糖與羥基肉桂酸等通過酯鍵、醚鍵形成酯類、醚類，在發酵過程中，酯鍵、醚鍵斷裂，酚酸和可溶性阿拉伯木聚糖被釋放，微生物維持自身生長的需要，可利用的營養成分已經基本消耗殆盡時，利用了一部分釋放出的可溶性阿拉伯木聚糖，使發酵后總酚含量高的菌株，可溶性阿拉伯木聚糖含量反而相對較低。

3 結論

圖4 霉菌固態發酵紫麥麩皮的可溶性阿拉伯木聚糖含量

適宜條件下固態發酵彩麥麩皮是提高游離酚酸含量有效的方法，不同種類菌株的發酵效果各不相同。選用適當的菌株發酵，對提高酚酸釋放及抗氧化能力有重要的意義。實驗室篩選出的霉菌固態發酵紫麥麩皮后，研究總酚含量、DPPH·清除率、酚酸組成以及可溶性阿拉伯木聚糖含量。不同菌株固態發酵的試驗結果表明，霉菌的發酵效果最好，霉菌Ⅳ-11 固態發酵紫麥麩皮后，具有較好的酚酸釋放及抗氧化能力。霉菌Ⅳ-11 發酵后總酚含量為3.55mg/g 麩皮，DPPH·清除率為51%，酚酸含量為2 922μg/g 麩皮。

不同來源麩皮篩選出的菌株及同一來源麩皮中篩選出的菌株固態發酵紫麥麩皮的結果呈現出差異性，這體現了不同的微生物群落對底物的利用有不同的特征。固態發酵有利于酚酸的釋放及抗氧化能力的提高，但菌株選擇不恰當會使酚酸含量降低，Jose Antonio Curiel［14］用乳酸菌發酵食品，酚酸含量降低。固態發酵過程中，發酵菌株的選擇非常重要。

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