帕拉米韋氯化鈉注射液細菌內毒素檢查方法的建立

喬世琴，孫著葉，李維剛，吳立磊（.日照市中醫醫院藥劑科，山東日照 76800；.山東綠因藥業有限公司，山東臨沂 76000）

帕拉米韋是由美國生物晶體公司研制的一種環戊烷神經氨酸酶抑制劑，是世界首個靜脈途徑治療流感的藥物，該藥可有效抑制各種流感病毒株，具有耐受性好、毒性小等優點。2010年由日本鹽野義制藥株式會社推廣上市，用于甲型、乙型流感病毒感染癥的治療[1]。2013年，我國國家食品藥品監督管理總局批準抗流感新藥帕拉米韋氯化鈉注射液上市，現有臨床試驗數據證明該藥對甲型和乙型流感有效[2]。但目前尚未有帕拉米韋氯化鈉注射液細菌內毒素檢查法的文獻報道。為確保臨床用藥安全，筆者采用細菌內毒素凝膠檢查法[3-4]檢測了帕拉米韋氯化鈉注射液中細菌內毒素，現報道如下。

1 材料

KXB-12A 型恒溫培養箱（上?？莆鲈囼瀮x器廠）；XW-8A型漩渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）；PHS-2F 型雷磁酸度計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；XS 105型電子天平（德國Sartorius公司）。

帕拉米韋氯化鈉注射液（山東綠因藥業有限公司，批號：130901、130902、130903，規格：60 ml∶300 mg）；鱟試劑[TAL，湛江安度斯生物有限公司，批號：1010211，標示靈敏度：0.25 EU/ml；福州新北生化工業有限公司，批號：1007121，標示靈敏度：0.125 EU/ml）]；細菌內毒素工作標準品（CSE，湛江安度斯生物有限公司，批號：1010150，規格：100 EU/ml）；細菌內毒素檢查（BET）用水（湛江安度斯生物有限公司，批號：1011230，規格：50 ml/瓶）。

2 方法與結果

2.1 樣品細菌內毒素限值（L）的確定

參考相關文獻[5-6]，確定大容量注射液的細菌內毒素限值L為0.5 EU/ml。根據公式L＝K/M計算。K 為人用每千克體質量每小時最大可接受的內毒素劑量，注射劑K＝5 EU/（kg·h）；M為人用每千克體質量每小時的最大劑量。帕拉米韋氯化鈉注射液靜脈注射最大用藥劑量為600 mg（120 ml），給藥時間每次至少為15 min，平均體質量按60 kg計，靜脈注射時間按1 h計，故L＝K/M＝2.5 EU/ml。根據《化學藥品注射劑安全性檢查法應用指導原則》的要求，為保證用藥安全，本研究規定帕拉米韋氯化鈉注射液的細菌內毒素限值為0.5 EU/ml。

2.2 樣品最小有效稀釋濃度（c）的確定

根據公式c＝λ/L計算。式中，L為0.5 EU/ml，λ為TAL 靈敏度。目前，市售TAL的λ為0.50、0.25、0.125、0.0625、0.03 EU/ml，得c為5.0、2.5、1.25、0.625、0.312 5 mg/ml。

2.3 TAL靈敏度復核試驗

根據2010年版《中國藥典》（二部）附錄TAL靈敏度復核試驗的方法操作[3]，結果均符合規定，詳見表1[注：“+”表示凝膠形成（陽性）；“－”表示凝膠未形成（陰性）]。

2.4 干擾預試驗

取BET用水將帕拉米韋氯化鈉注射液稀釋成質量濃度為5.0、2.5、1.25、0.625、0.312 5 mg/ml 的系列濃度溶液，作為供試品陰性對照溶液（NPC）。另制備相同濃度的系列供試品溶液，使每一供試品溶液中含有2.0λ（0.50 EU/ml）的細菌內毒素，作為陽性對照溶液（PPC）。另設CSE的陽性對照管（PC）和BET用水陰性對照管（NC）各2管，按細菌內毒素檢查法操作，結果見表2（注：“+”表示陽性反應；“－”表示陰性反應）。

表1 TAL靈敏度復核結果Tab 1 Recheck results of TAL sensitivity test

表2 樣品干擾預試驗結果Tab 2 Results of pre-interference test of samples

預試驗結果表明，帕拉米韋氯化鈉注射液原液對兩批TAL均有強抑制作用，樣品經稀釋后，TAL的最大不干擾濃度（2.5 mg/ml）對試驗可能無干擾。

2.5 干擾試驗

根據預試驗結果，用質量濃度為2.5 mg/ml 的供試品溶液及BET 用水分別稀釋CSE，制成細菌內毒素濃度為0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 EU/ml 的系列溶液，與兩批TAL 反應，按2010年版《中國藥典》（二部）附錄中細菌內毒素檢查法進行干擾試驗，結果見表3[注：Es為BET用水制成的細菌內毒素標準溶液反應終點濃度的幾何平均值，Et為用供試品溶液制成的細菌內毒素標準溶液反應終點濃度的幾何平均值；Es＝lg－1（∑Xs/4），Et＝lg－1（∑Xt/4）；“+”表示陽性反應；“－”表示陰性反應]。

試驗結果表明，Es為2～0.5 EU/ml，Es/Et為0.5～2，說明質量濃度為2.5 mg/ml 的樣品溶液對TAL無干擾，可用于細菌內毒素檢查。

2.6 樣品細菌內毒素檢查

表3 樣品干擾試驗結果Tab 3 Results of interference test of samples

取3 批次的樣品各適量，加BET 用水制成質量濃度為2.5 mg/ml的溶液，使用λ為0.25 EU/ml的TAL，按文獻[7]方法進行細菌內毒素檢查，并按要求做陽性（PPC、PC）、陰性（NPC、NC）對照，結果均符合規定，詳見表4（注：“+”表示陽性反應；“－”表示陰性反應）。

表4 細菌內毒素檢查結果Tab 4 Results of bacterial endotoxin test

3 討論

細菌內毒素檢查法是通過TAL與細菌內毒素間產生凝聚反應以判斷供試品中細菌內毒素是否符合規定的一種方法，具有操作簡單、檢測周期短、靈敏度高、結果準確等優點[8]。在進行預干擾試驗時，加入BET 用水將帕拉米韋氯化鈉注射液稀釋并溶解到質量濃度為2.5 mg/ml時不干擾測定。本試驗中筆者采用兩家不同企業的TAL對3個批號的樣品進行試驗對比[9]，在樣品質量濃度稀釋至2.5 mg/ml及以下時，不干擾細菌內毒素檢查。因此，帕拉米韋氯化鈉注射液用凝膠法進行細菌內毒素檢查是可行的。

綜上所述，本方法可用于帕拉米韋氯化鈉注射液的細菌內毒素檢查。

[1]陳小勇，李佩杰，梁杰.一種帕拉米韋德制備方法：中國，201110034757.9[P].2011-02-09.

[2]國家食品藥品監督管理總局.帕拉米韋氯化鈉注射液[EB/OL].（2013-04-05）[2013-08-20].http：//www.sfda.gov.cn/WS01/CL0001/.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄85.

[4]劉海疆，陳志勇，田冰，等.長春西汀氯化鈉注射液細菌內毒素檢查法的研究[J].黑龍江醫藥，2014，27（1）：108.

[5]李霞.細菌內毒素檢查法在藥品申報資料中應注意的問題[J].中國藥事，2007，21（6）：401.

[6]李榮，吳玲.動態濁度法檢測乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液中的細菌內毒素[J].中國藥房，2012，23（9）：837.

[7]厲青，陳娟紅，陸金花.注射用丁二磺酸腺苷蛋氨酸內毒素檢查方法的建立[J].中國藥房，2013，24（25）：2 376.

[8]周梅，武谷.注射用鹽酸吉西他濱細菌內毒素檢查方法的研究[J].中國藥房，2013，24（1）：77.

[9]蔣立云，湯群，堵嫻，等.注射用嗎替麥考酚酯的細菌內毒素檢查法可行性研究[J].藥物分析雜志，2013，28（3）：490.