RP-HPLC法測定二十味肉豆蔻散中去氫二異丁香酚的含量Δ

楊巧虹，康新莉，周雪杉，阿 萍，顧 健，譚 睿#（1.重慶醫療器械質量檢驗中心，重慶 0117；.西南交通大學生命科學與工程學院，成都 61001；.西藏自治區藥品檢驗所，拉薩 850000；.西南民族大學民族醫院研究院，成都 610051）

肉豆蔻散是由肉豆蔻、沉香、丁香、降香、藏茴香和余甘子等20 味藏藥材組方的復方制劑[1]。二十味肉豆蔻散是在丸劑的基礎上改制的新劑型，具有易分散、起效快的特點，較丸劑的適用范圍更廣。新劑型的開發，需要對其主要藥效成分的含量進行控制，以確保其臨床療效。為此，筆者參考有關文獻[2-3]，建立了采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測定二十味肉豆蔻散中去氫二異丁香酚的含量，以為二十味肉豆蔻散的質量標準提供可靠依據。

1 材料

LC-10A 型HPLC 儀，包括CLASS-VP5.03 色譜工作站（日本島津公司）；SK7200LH型超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；BSA224S型電子天平（德國賽多利斯公司）。

二十味肉豆蔻散（批號：20111205、20111021、20120214）、缺肉豆蔻的陰性樣品均由青海省藏醫院制劑科提供；去氫二異丁香酚對照品（成都市食品藥品檢測中心，批號：110725-201112）；甲醇為色譜純，無水乙醇、乙酸乙酯為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Comatex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（68∶32，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：276 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取去氫二異丁香酚對照品0.5 mg，加甲醇定容至10 ml量瓶中，搖勻，作為對照品母液；精密量取上述對照品母液1 ml，置于50 ml 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 稱取樣品粉末約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入無水乙醇40 ml，稱定質量，超聲（功率：120 W，頻率：40 kHz）處理40 min，放冷，再次稱定質量，用無水乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 取缺肉豆蔻的陰性樣品適量，按“2.2.2”項下方法制備，即得。

2.3 系統適用性試驗

精密吸取“2.2”項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μl，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，色譜見圖1。理論板數按去氫二異丁香酚計均不低于3 000，分離度＞1.5。

2.4 線性關系考察

圖1 高效液相色譜圖A.供試品溶液；B.對照品溶液；C.陰性對照溶液；1.去氫二異丁香酚Fig 1 HPLC chromatogramsA.solution of test sample；B.solution of reference；C.solution of negative control；1.dehydrodiisoeugenol

精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液4、7、10、13、16、20 μl，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得去氫二異丁香酚的回歸方程為y＝4 302 637.68x－80 552.67（r＝0.999 7）。結果表明，去氫二異丁香酚進樣量在0.036 8～0.184 0 μg 范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，RSD＝1.94%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

精密吸取同一供試品（批號：20111205）溶液適量，分別于放置0、2、4、6、8、10、12 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，RSD＝1.82%（n＝7），表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.7 重復性試驗

取同一批樣品（批號：20111205）6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，RSD＝2.84%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

稱取已知含量的同一樣品（批號：20111205）共6 份，精密稱定，置于100 ml具塞錐形瓶中，加入“2.2.1”項下對照品母液130 μl，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率，結果見表1。

2.9 樣品含量測定

取3批樣品各適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，并計算樣品含量，結果見表2。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

表2 樣品含量測定結果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

在色譜條件的建立過程中，筆者參考相關文獻[4-6]分別考察了柱溫為25、30、35、40 ℃時的色譜行為。結果表明，柱溫對色譜峰影響不大，故選擇常用柱溫30 ℃。筆者又分別考察了甲醇-水（70∶30，V/V）、甲醇-水（68∶32，V/V）和甲醇-水（66∶34，V/V）等不同流動相系統，結果甲醇-水（68∶32，V/V）作為流動相時分離度、峰形均較好。取去氫二異丁香酚對照品溶液進行全波長掃描，結果去氫二異丁香酚和肉豆蔻醚的最大吸收波長分別為201、276 nm，但在201 nm波長處流動相的吸收較大，影響基線，故以276 nm為檢測波長。

3.2 樣品的處理方法

筆者分別以甲醇、80%甲醇、無水乙醇、80%乙醇、乙酸乙酯為提取溶劑，結果無水乙醇提取含量最高；又分別比較了超聲提取、回流提取、振搖提取的提取率，結果超聲提取時提取率較高；又考察了超聲10、20、30、40、50、60 min的提取效率，結果提取30 min提取率基本穩定，故選擇超聲提取30 min。

3.3 測定結果的分析

由于本試驗僅局限于3批樣品，去氫二異丁香酚的平均含量為0.109 mg/g，為了對其質量標準的制訂提供依據，建議質量控制時樣品中去氫二異丁香酚的含量不得低于0.098 mg/g。

[1]WS3-BC-0164-95.中華人民共和國衛生部藥品標準：藏藥：第一冊：肉豆蔻散[S].

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：142-143.

[3]譚銳，張良.藏藥二十味肉豆蔻丸中丁香酚的HPLC測定[J].中國藥事，2003，17（4）：224.

[4]袁子民，陳劍鋒，賈天柱.RP-HPLC測定麩煨肉豆蔻中去氫二異丁香酚的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（18）：60.

[5]王旭梅，龐玉華.肉蔻五味丸質量標準研究[J].中國藥房，2008，19（30）：2 382.

[6]田偉剛.肉豆蔻提取物的藥理作用[J].中國社區醫師：醫學專業，2012，14（16）：44.