頂空氣相色譜法測定胡黃連苷Ⅱ原料藥中7種有機溶劑殘留量

汪 斌，鄭 璐，姚仲青，李 鵬，薛 明，陳煒偉（揚子江藥業集團中藥研究院，江蘇泰州 225321）

胡黃連苷Ⅱ（PicrosideⅡ）是從玄參科多年生植物胡黃連的干燥根莖中分離提純的環烯醚萜類化合物[1-2]，具有保肝利膽、抗菌抗炎、調節血脂的作用[3-4]。在胡黃連苷Ⅱ制備過程中，可能會殘留一定量的有機溶劑。為保證藥品質量和用藥安全，應嚴格限制制備過程中帶入的殘留溶劑含量。但目前有關胡黃連苷Ⅱ原料藥中有機溶劑殘留量的測定尚未有文獻報道。為此，筆者根據2010 版《中國藥典》（二部）中關于殘留溶劑測定法的指導原則[5]，采用頂空氣相色譜法[6]，對胡黃連苷Ⅱ原料藥中有機溶劑殘留量進行了系統分析，建立了同時測定胡黃連苷Ⅱ原料藥中甲醇、乙醇、乙酸乙酯、苯、甲苯、苯乙烯和二乙烯苯7種溶劑量殘留的方法。

1 材料

7890B 型氣相色譜儀，包括7697A 型自動頂空進樣器（美國Agilent公司）；GWA-UN2-C30型超純水器（北京普析通用儀器有限責任公司）；XS205Dual Range十萬分之一分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；KH-700DB 型數控超聲儀（昆山禾創超聲儀器有限公司）。

胡黃連苷Ⅱ（揚子江藥業集團有限公司，批號：20140405-1、20140405-2、20140405-3，純度均＞96%）；甲醇、乙醇、乙酸乙酯、甲苯、苯、苯乙烯、二乙烯苯對照品（純度均＞99.5%），N-N二甲基甲酰胺（DMF）均購至國藥集團化學試劑有限公司均為色譜純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：以6%氰丙基苯-94%二甲基硅氧烷（DB-624）為固定液的毛細管柱（30 m×0.32 mm，1.80 μm）；程序升溫：初始溫度40 ℃，保持10 min，以10 ℃/min 升溫至220 ℃，保持10 min；進樣口溫度：200 ℃；檢測器：氫火焰離子化檢測器（FID）；溫度：250 ℃；載氣：高純氮氣；載氣流速：35 ml/min；分流比：10∶1；頂空加熱溫度：85 ℃；平衡時間：45 min；頂空瓶裝樣量：5 ml；進樣量：1 ml。

2.2 溶液的制備

2.2.1 空白溶液 精密量取50%DMF 5 ml，置于20 ml頂空瓶中，加蓋密封，作為空白溶液。

2.2.2 對照品貯備液 取甲醇對照品300 mg、乙醇對照品500 mg、乙酸乙酯對照品500 mg、甲苯對照品90 mg，分別置于10 ml 量瓶中，加入50%DMF 溶解并定容，得甲醇、乙醇、乙酸乙酯、甲苯對照品貯備液；精密稱取苯10 mg，置于10 ml 量瓶中，加入50%DMF溶解并定容，精密量取1 ml，置于50 ml量瓶中，加入50%DMF溶解并定容，得苯對照品貯備液；精密稱取苯乙烯、二乙烯苯各20 mg，分別置于10 ml 量瓶中，加入50%DMF溶解并定容，分別精密量取1 ml，置于10 ml量瓶中，加入50%DMF溶解并定容，得苯乙烯、二乙烯苯對照品貯備液。

2.2.3 混合對照品溶液 分別精密量取上述對照品貯備液1 ml，置于同一100 ml 量瓶中，加入50%DMF 溶解并定容，搖勻，精密量取5 ml，置于20 ml頂空進樣瓶中，作為混合對照品溶液。

2.2.4 供試品溶液 精密稱取胡黃連苷Ⅱ0.25 g，置于頂空進樣瓶中，精密加入50%DMF 5 ml，加蓋密封，超聲（功率：100 W，頻率：40 kHz）處理5 min，即得。

2.3 專屬性試驗

取“2.2”項下空白溶液、混合對照品溶液及供試品溶液各適量，按“2.1”項下氣相色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結果表明，空白溶液中的雜質峰對測定無干擾。

2.4 線性關系考察

分別精密量取“2.2.2”項下各對照品貯備液各1 ml，置于同一25 ml 量瓶中，加入50%DMF 溶解并定容，搖勻，作為混合對照品貯備液。分別精密量取混合對照貯備液0.50、0.75、1.00、1.50、1.75、2.00 ml，置于10 ml 量瓶中，分別加入50%DMF 溶解并定容；分別精密量取5 ml，置于頂空進樣瓶中，按“2.1”項下氣相色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以質量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程及線性范圍詳見表1。

圖1 氣相色譜圖A.空白溶液；B.對照品溶液；C.供試品溶液；1.甲醇；2.乙醇；3.乙酸乙酯；4.苯；5.甲苯6.DMF溶液；7.苯乙烯；8～13.二乙烯苯Fig 1 GC chromatogramsA.blank solution；B.reference solution；C.test sample solution；1.methanol；2.ethanol；3.ethyl acenitrile；4.benzene；5.methylbenzene；6.DMF solution；7.phenylethylene；8-13.divinylbenzene

表1 回歸方程及線性范圍Tab 1 Regressive equations and linear ranges

2.5 檢測限及定量限[5]

以信噪比為3 計算甲醇、乙醇、乙酸乙酯、苯、甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的檢測限分別為0.05、1.12、0.02、12.62、5.16、1.40、450.00 ng/ml；以信噪比為10 計算甲醇、乙醇、乙酸乙酯、苯、甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的定量限分別為0.16、4.30、0.07、37.00、18.30、4.39、550.00 ng/ml。

2.6 精密度試驗

按“2.4”項下方法制備甲醇、乙醇、乙酸乙酯、甲苯質量濃度分別為0.188、0.307、0.302、0.062 7 mg/ml，苯、苯乙烯、二乙烯苯質量濃度分別為0.118、1.745、1.880 μg/ml 的混合對照品溶液，按“2.1”項下氣相色譜條件進樣測定6 次，記錄峰面積。結果，各成分峰面積的RSD 均小于3%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

精密吸取“2.2.4”項下供試品溶液（批號：20140405-1）適量，于室溫（25 ℃）下放置0、2、4、6、8、10 h時按“2.1”項下氣相色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，各成分峰面積的RSD均小于3%（n＝6），表明供試品溶液在10 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗

精密稱取胡黃連苷Ⅱ（批號：20140405-1）適量，按“2.2.4”項下方法制備供試品溶液6 份，再按“2.1”項下氣相色譜條件進行測定，記錄峰面積。結果，各成分均未檢出，表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取樣品（批號：20140405-1）6 份，每份約0.25 g，置于各頂空進樣瓶中。另按“2.2.2”項下方法制備相當于各對照品質量濃度的100%的標準溶液，分別取該標準溶液5 ml 加入盛有樣品的頂空進樣瓶中，再按“2.1”項下氣相色譜條件進樣，計算加樣回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 2 Results of recovery rate（n＝6）

2.10 樣品中有機溶劑殘留量的測定

取3 批樣品（20140405-1、20140405-2、20140405-3）各適量，按“2.2.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下氣相色譜條件進樣測定，以外標一點定量法計算有機溶劑殘留量。結果，3批樣品均未檢出。

3 討論

3.1 檢測指標的確立

胡黃連苷Ⅱ原料藥在分離和純化過程中均使用了HPD-100 型大孔吸附樹脂及有機溶劑甲醇、乙醇、乙酸乙酯，從用藥的安全性考慮，本試驗對大孔樹脂可能引入的苯、甲苯、苯乙烯、二乙烯苯及制備純化過程使用的甲醇、乙醇、乙酸乙酯的殘留量進行控制。

3.2 溶劑的選擇

胡黃連苷Ⅱ中可能存在的殘留溶劑在50%DMF中溶解度較好，且DMF 沸點高，對其他峰的干擾較小。故將50%DMF作為本研究的溶劑。

3.3 色譜條件的選擇

本試驗選擇頂空進樣的方法，避免了樣品中難溶性物質對色譜柱的污染；檢測的有機溶劑組分較多，極性差異大，筆者曾選用HP-5毛細管柱測定有機物殘留，發現各組分不能達到基線分離，且DMF對測定有干擾；選用DB-624毛細管柱，各組分均能獲得較好的分離，峰型較好，且DMF不影響測定。采用程序升溫的方式，使7 種有機溶劑達到了完全分離，且縮短了分析周期，提高了檢測效率。在加樣回收率試驗中，甲醇、乙醇、乙酸乙酯及苯的沸點較低，甲苯、二乙烯苯沸點較高，加樣回收率較高；苯乙烯沸點較高，加樣回收率較低，但均符合氣相色譜要求[7-8]，且RSD均小于3.5%。

綜上所述，該方法專屬性強，操作簡便快速，結果準確，可用于胡黃連苷Ⅱ原料藥有機溶劑殘留量的測定。

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