骨愈搽劑中總黃酮及其單體成分的體外透皮行為研究Δ

高 瑛，趙淑慧，陸 洋，溫 然（1.北京中醫醫院順義醫院，北京 101300；.北京中醫藥大學中藥學院，北京 10010）

骨愈搽劑處方來源于北京中醫醫院順義醫院骨外科治療骨性關節炎應用多年的臨床經驗方，由透骨草、雞血藤、艾葉、紅花等6味中藥組成，具有祛風除濕、活血通絡的功效，將其制成搽劑后可具有使用攜帶方便、有效成分含量高且可控、患者依從性好等特點，更加適合現代社會廣泛應用。該處方中有效成分以總黃酮為主，其含量最高，單體成分以羥基紅花黃色素A（HSYA）最明確，故本研究以總黃酮、HSYA 為指標，考察骨愈搽劑的體外透皮情況，并比較兩指標成分體外透皮行為的相關性，為骨愈搽劑的研制開發提供數據支持。根據2010年版《中國藥典》（一部）[1]及處方藥味透骨草、紅花、雞血藤[2-4]等相關文獻報道，總黃酮的含量以蘆丁為對照品，采用紫外-可見分光光度法測定，HSYA 的含量采用高效液相色譜法進行測定。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；TU-1810 紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；BS 110S 電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；YB-P6 智能透皮試驗儀（天津藥典標準儀器廠）；KQ5200DA超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

骨愈搽劑[北京中醫醫院順義醫院自制，批號：20120830，規格：1 g（生藥）/ml]；蘆丁對照品（批號：100080-200707，純度：90.5%，供紫外含量測定用）、HSYA 對照品（批號：111637-201106，純度：98%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，乙醇等其他試劑均為分析純。

1.3 動物

2 方法與結果

2.1 小鼠皮膚的處理[5]

將小鼠斷頸處死，取適量脫毛膏均勻涂于小鼠腹部脫去鼠毛，取下腹皮，用干棉花將脂肪及黏液組織擦試干凈，用清水和生理鹽水反復沖洗后，包于鋁箔紙內，于冰箱冷凍保存備用。實驗前自然解凍，目測皮膚完整性，不得有任何破損。

2.2 總黃酮的含量測定

2.2.1 測定方法 將體外透皮試驗取出的4 ml接收液置于10 ml量瓶中，以NaNO2-Al（NO3）3為顯色劑顯色，即加入50 mg/ml NaNO2溶液0.4 ml，搖勻后靜置6 min；再加入100 mg/ml Al（NO3）3溶液0.4 ml，搖勻后靜置6 min；加 入100 mg/ml NaOH 溶液4.0 ml，再加50%乙醇定容至刻度，搖勻后再靜置15 min。以無接收液的陰性試劑為空白，采用紫外-可見分光光度法在511 nm波長處測定吸光度，計算接收液中總黃酮含量。

2.2.2 標準曲線的制備 精密量取蘆丁對照品溶液（0.16 mg/ml）0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 ml，分別置于10 ml 量瓶中，加50%乙醇至4.0 ml，按“2.2.1”項下方法顯色，以無蘆丁對照品溶液的陰性試劑為空白，分別在511 nm 波長處測定吸光度。以質量濃度（c）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為A＝10.552c－0.003 7（r＝0.999 7），蘆丁的線性范圍為0.008～0.064 mg/ml。

2.2.3 回收率試驗 取空白接收液，加入0.008、0.032、0.064 mg/ml 的蘆丁對照品溶液制備成樣品溶液，紫外-可見分光光度法測定總黃酮含量，每組平行操作3 份。結果，低、中、高質量濃度樣品溶液的回收率分別為（101.74±1.25）%、（97.60±0.76）%、（99.11±0.59）%，RSD 分別為1.23%、0.78%、0.60%（n＝3）。

2.2.4 精密度試驗 按“2.2.3”項下方法制備低、中、高質量濃度的樣品溶液，紫外-可見分光光度法測定，每組重復測定5次。結果，峰面積的RSD 分別為3.13%、1.22%、0.97%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.3 HSYA的含量測定[6]

2.3.1 色譜條件[7]色譜柱：DiamonsilTM-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-0.7%磷酸（26 ∶2 ∶72，V/V/V），流速：1 ml/min；檢測波長：403 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl。

2.3.2 供試品溶液的制備 將接收液用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液即得供試品溶液。

2.3.3 標準曲線的制備 精密稱取HSYA 對照品3.03 mg，置于10 ml量瓶中，加25%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得母液。分別精密移取適量母液，加25%甲醇制成質量濃度為0.015 15、0.030 3、0.090 9、0.151 5、0.303 0、0.757 5、1.212 0 mg/L 的對照品溶液，進樣測定，記錄色譜。以質量濃度（c）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標，進行回歸分析，得回歸方程為A＝58.120c+0.015 9（r＝0.999 9），HSYA 線性范圍為0.015 15～1.212 0 mg/L。

2.4 體外透皮試驗

采用垂直式Franz 擴散池法[8]，使用YB-P6 智能透皮試驗儀，上室為擴散室，下室為接收室，擴散室容積為23 ml，有效擴散面積為3.14 cm2，恒溫水浴加熱，溫度37 ℃。試驗時，接收室加滿釋放介質（20%乙醇-生理鹽水），將小鼠鼠皮附在接收室上，將其固定在兩室之間，再將藥液加于鼠皮上，排除氣泡。磁攪拌轉速設定為400 r/min，在設定的時間點l、2、4、6、8、12 h精密移取5 ml接收液，同時補加等量等溫的新鮮接收液。取4 ml 接收液按“2.2.1”項下方法測定接收液中總黃酮含量；其余接收液用0.45 μm微孔濾膜過濾得到樣品，按“2.3.1”項下方法測定HSYA含量。

根據公式計算不同取樣點總黃酮和HSYA 的單位面積累積滲透量：Q＝/A，式中Q為累積滲透量，A為有效經皮吸收面積，V為接收液體積，Vi為取樣體積，cn為第n次取樣測得的接收液中藥物的質量濃度；ci為第i（i≤n－1）個取樣點測得的接收液中藥物的質量濃度；為取樣時帶走的藥物累積和。滲透吸收百分率＝（Q×A）/W×100%，其中W為給藥量。以藥物的Q對取樣時間t進行線性回歸分析，所得斜率即為透過速率。骨愈搽劑中總黃酮和HSYA 的透皮吸收曲線圖見圖1，12 h內的滲透吸收百分率見表1、表2，平均單位面積累積滲透量-時間模型擬合方程見表3、表4。

圖1 骨愈搽劑中總黃酮和HSYA的滲透吸收曲線圖（n＝5）Fig 1 Transdermal absorption curve of total flavonoids and HSYA in Guyu liniment（n＝5）

表1 12 h內總黃酮的滲透吸收百分率Tab 1 Transdermal absorption percentage of total flavonoids within 12 h

表2 12 h內HSYA的滲透吸收百分率Tab 2 Transdermal absorption percentage of HSYA within 12 h

表3 總黃酮平均單位面積累積滲透量-時間模型擬合方程Tab 3 Model fitting equation of average accumulative permeation quantity of total flavonoids per unit areatime

表4 HSYA平均單位面積累積滲透量-時間模型擬合方程Tab 4 Model fitting equation of average accumulative permeation quantity of HSYA per unit area-time

由表3 和表4 可知，骨愈搽劑中總黃酮和HSYA 的透皮吸收過程均符合Higuchi 方程，透過速率分別為126.24、47.516 μg/（cm2·h）。

3 討論

黃酮類化合物是一類具有C6-C3-C6結構的低分子質量化合物[9]，具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、鎮痛、鎮靜等多方面藥理活性，為骨科常用中草藥的活性成分。黃酮類化合物對骨關節炎的治療作用已有廣泛研究，其可抑制滑膜組織的異常增殖、抑制關節軟骨病變、保護成骨細胞缺氧損傷、激活成骨細胞而促進骨形成等[10-14]。因此，開發黃酮類化合物治療骨科疾病的相關制劑具有重要意義。

骨愈搽劑屬于經皮給藥系統制劑，黃酮類化學成分主要通過釋放到達皮膚表面，進而經過表皮進入血液循環發揮作用，藥物成分的透皮吸收速率會直接影響到臨床療效[15]。因此，藥物的滲透吸收百分率是評價經皮給藥制劑的重要指標。

本試驗研究發現，骨愈搽劑中總黃酮的透皮數據擬合符合Higuchi 方程，12 h 內滲透吸收百分率為8.23%，透過速率為126.24 μg/（cm2·h）；HSYA 的透皮數據擬合亦符合Higuchi方程，12 h 內滲透吸收百分率為28.12%，透過速率為47.516 μg/（cm2·h）。這說明骨愈搽劑中總黃酮和HSYA 的累積滲透量Q均隨時間t的增加而增加，并與t1/2有顯著相關性；總黃酮的透皮行為與單體黃酮HSYA的透皮行為具有相似性，均可用Higuchi 方程描述其透皮過程，屬于骨架擴散型透皮給藥系統，具有長效緩釋的特點。然而，是否能用Higuchi 方程繼續描述骨愈搽劑處方中的其他單體黃酮成分以及Higuchi 方程是否為黃酮類化合物透皮吸收過程的通用方程，則需要更進一步的研究。

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