光譜法研究頭孢丙烯與牛血清白蛋白的相互作用Δ

劉 里，成飛翔（曲靖師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，云南曲靖 655011）

血清白蛋白是一類重要的運(yùn)輸性蛋白，在生物體內(nèi)的循環(huán)系統(tǒng)中含量非常豐富，幾乎占血清蛋白的60%。近年來采用光譜研究藥物與血清白蛋白的相互作用已成為生命科學(xué)、化學(xué)、藥學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，這對于了解生命過程、藥物作用機(jī)制及藥物分子設(shè)計(jì)等都具有重要作用[1-4]。因結(jié)構(gòu)上和人血清白蛋白的相似性，牛血清白蛋白（BSA）被廣泛運(yùn)用于與藥物結(jié)合作用的研究。頭孢丙烯（Cefprozil，CE）屬第二代高效、低毒、耐酶頭孢菌素類抗生素，常用于治療敏感菌所致的輕、中度感染，包括上、下呼吸道感染，以及皮膚和皮膚軟組織感染等[5]。因此，研究CE 與BSA 的相互作用對理解藥物的作用機(jī)制具有重要意義。以往研究藥物與BSA相互作用主要集中在猝滅機(jī)制探討上，而本文在優(yōu)化試驗(yàn)條件的情況下研究了CE與BSA的結(jié)合反應(yīng)，除了常規(guī)的作用機(jī)制研究外，還深入探討了不同溫度下兩者的結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合力類型、結(jié)合部位、藥物之間的協(xié)同性以及藥物對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響等，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器

pHS-3C 型精密酸度計(jì)（上海虹益儀器儀表有限公司）；Cary50型紫外-可見分光光譜儀（美國瓦里安技術(shù)中國有限公司）；F-4600 型熒光光譜儀（日本日立公司，測定參數(shù)：狹縫寬度5 nm，光電倍增管負(fù)高壓400 V）。

1.2 藥品與試劑

CE（中國食品藥品檢定研究院，批號：130567-201203，純度：94.9%）；牛血清白蛋白（上海楷洋生物技術(shù)有限公司，純度：98%）；其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 猝滅試驗(yàn)

取10.0 ml比色管，加入BSA（1.0×10－5mol/L）2.0 ml，再分別加入9.490×10－5mol/L的CE溶液0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.25、2.5、3 ml，然后加入三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）溶 液（0.2 mol/L、pH 7.4）2.0 ml、NaCl 溶液（0.5 mol/L）2.0 ml（以維持正常生理離子強(qiáng)度），最后用水稀釋至刻度并搖勻，分別在289、299、309 K 溫度下作用50 min。此時(shí)體系中BSA 的濃度為2.0×10－6mol/L，CE 的濃度分別為0、0.237 3×10－6、0.474 5×10－6、0.711 8×10－6、0.949 0×10－6、1.186 3×10－6、1.423 5×10－6、1.660 8×10－6、1.898 0×10－6、2.135 3×10－6、2.372 5×10－6、2.847 0×10－6mol/L（編號依次為1～12）。作用完畢后立即以最大激發(fā)波長（λex）280 nm、最大發(fā)射波長（λem）342 nm在熒光光譜儀上記錄熒光猝滅光譜，并分別以Δλ＝15、60 nm 繪制289 K溫度下CE-BSA體系的同步熒光光譜，記錄F0和F（F和F0分別指CE存在與不存在時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度）。

2.2 熒光猝滅光譜

289 K溫度下CE-BSA體系的熒光猝滅光譜見圖1。

圖1 289 K溫度下CE-BSA體系的熒光猝滅光譜圖Fig 1 Fluorescence quenching spectrogram of CE-BSA system at 289 K

由圖1 可見，CE 在測量波段沒有熒光，而BSA 的熒光較強(qiáng)。在λex/λem＝280/342 nm 處，當(dāng)CE 加入到BSA 之后，雖然λex/λem幾乎未發(fā)生變化，但是其熒光強(qiáng)度明顯隨著CE濃度的增加而逐漸減弱，表明CE 能猝滅BSA 的熒光，兩者之間存在相互作用。

2.3 猝滅類型的判斷

引起熒光猝滅的原因很多，但通常分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。常用溫度的改變而引起體系的變化來確定猝滅類型：在動(dòng)態(tài)猝滅中分子擴(kuò)散起主導(dǎo)，猝滅常數(shù)會(huì)隨著溫度的升高而增大；對于靜態(tài)猝滅，因有新物質(zhì)生成，穩(wěn)定性起主導(dǎo)作用，溫度越高，猝滅常數(shù)反而越小[6]。

2.3.1 Stern-Volmer 方程 動(dòng)態(tài)猝滅過程應(yīng)遵循Stern-Volmer方程：F0/F＝1+KSV[c]＝1+Kqτ0[c]，式中，KSV為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，Kq為動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)[動(dòng)態(tài)猝滅時(shí)最大值約為2×1010L/（mol·s）][6]，τ0為熒光體平均壽命（一般為10－8s 數(shù)量級）[6]，[c]為CE 濃度。以289、299、309 K 時(shí)的F0/F對[c]作圖，根據(jù)Kq＝KSV/τ0可求出不同溫度下的Kq。不同溫度下CE 對BSA 熒光猝滅的Stern-Volmer曲線見圖2，Stern-Volmer方程及相關(guān)參數(shù)見表1。

圖2 不同溫度下CE-BSA體系的Stern-Volmer曲線Fig 2 Stern-Volmer curves of CE-BSA system at different temperatures

表1 不同溫度下CE-BSA 體系的Stern-Volmer 方程及相關(guān)參數(shù)Tab 1 Stern-Volmer equations and correlative parameters of CE-BSA system at different temperatures

由表1可見，3個(gè)溫度下的Kq比動(dòng)態(tài)猝滅最大速率常數(shù)[2×1010L/（mol·s）]大2個(gè)數(shù)量級，說明CE對BSA的猝滅不屬于動(dòng)態(tài)猝滅。由圖2 可知，3 個(gè)溫度下的Stern-Volmer 曲線均呈良好的線性關(guān)系，且隨著溫度的升高，直線斜率即KSV減小，正好與靜態(tài)猝滅機(jī)制一致。

2.3.2 Lineweaver-Burk方程 若CE對BSA為靜態(tài)猝滅，應(yīng)符合Lineweaver-Burk 方程[7-9]：（F0－F）－1＝F0－1+（KLBF0[c]）－1，式中，KLB為靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)。以（F0－F）－1對[c]－1作不同溫度下的Lineweaver-Burk 曲線。不同溫度下FCE 對BSA 熒光猝死的Lineweaver-Burk 曲線見圖3，Lineweaver-Burk 方程及相關(guān)參數(shù)見表2。

圖3 不同溫度下CE-BSA體系的Lineweaver-Burk曲線Fig 3 Lineweaver-Burk curves of CE-BSA system at different temperatures

由圖3 可知，隨著溫度的升高，直線斜率逐漸增大，則KLB逐漸下降，這與因靜態(tài)猝滅方式而形成的復(fù)合物隨溫度升高越不穩(wěn)定的作用機(jī)制一致。由表2可知，3個(gè)溫度下的KLB都在104數(shù)量級以上，表明CE 與BSA 由于發(fā)生靜態(tài)猝滅而結(jié)合力較強(qiáng)。

表2 不同溫度下CE-BSA體系的Lineweaver-Burk方程及相關(guān)參數(shù)Tab 2 Lineweaver-Burk equations and correlative parameters of CE-BSA system at different temperatures

2.3.3 紫外吸收光譜[7-9]按“2.1”項(xiàng)下方法制備289 K下作用50 min 的CE-BSA 體系1～12，以相應(yīng)濃度的CE 為參比，在紫外-可見光譜儀上對體系進(jìn)行紫外光譜掃描，得到CE 與BSA結(jié)合后的紫外吸收光譜圖。紫外吸收光譜見圖4。

圖4 紫外吸收光譜圖Fig 4 UV absorption spectrum

由圖4 可見，CE 的加入使BSA 中苯環(huán)上的π-π＊躍遷引起的特征吸收峰從280 nm 移到274 nm，吸收強(qiáng)度也隨CE 濃度的增加而增加。CE 的加入引起B(yǎng)SA 紫外吸收光譜的變化這一現(xiàn)象，說明CE與BSA間發(fā)生反應(yīng)，有新物質(zhì)生成，更進(jìn)一步證明兩者之間的相互作用機(jī)制屬于靜態(tài)猝滅機(jī)制。

2.4 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的計(jì)算

如CE與BSA存在n個(gè)等同且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，其相互作用的關(guān)系應(yīng)符合雙對數(shù)方程：lg[（F0－F）/F]=lgKb+nlg[c]。分別在289、299、309 K 溫度下，以lg[（F0－F）/F]對lg[c]作圖，以直線的斜率和截距求出CE 與BSA 不同溫度下的結(jié)合常數(shù)（Kb）和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）。不同溫度下lg[（F0－F）/F]-lg[c]曲線見圖5，不同溫度下CE 對BSA 熒光猝滅的雙對數(shù)方程及相關(guān)參數(shù)見表3。

圖5 不同溫度下CE-BSA體系的lg[（F0－F）/F]-lg[c]曲線Fig 5 lg[（F0－F）/F]-lg[c]curves of CE-BSA system at different temperatures

表3 不同溫度下CE-BSA體系的雙對數(shù)方程及相關(guān)參數(shù)Tab 3 Double logarithmic equations and correlative parameters of CE-BSA system at different temperatures

由表3 可見，3 個(gè)溫度下的n都約等于1，表明CE 與BSA結(jié)合后可形成一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。隨著溫度增加，Kb和n值減少的程度不大，表明CE 與BSA 的相互作用對溫度變化不是很敏感。這說明溫度的提升不利于血清白蛋白攜帶著CE 在體內(nèi)進(jìn)行運(yùn)轉(zhuǎn)、貯存和分配。

2.5 熱力學(xué)常數(shù)和作用力類型判斷

根據(jù)熱力學(xué)公式[10]計(jì)算289、299、309 K溫度下CE與BSA結(jié)合反應(yīng)的焓變（ΔH）、熵變（ΔS）及吉布斯自由能變（ΔG），結(jié)果見表4。

表4 不同溫度下CE與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Tab 4 Thermodynamic parameters of the interaction between CE and BSA at different temperatures

由表4 可見，ΔG＜0，表明BSA 與CE 的反應(yīng)能自發(fā)進(jìn)行；ΔH＜0，表明反應(yīng)為放熱反應(yīng)；ΔH＜0且ΔS＜0，表明氫鍵和范德華力是CE與BSA的主要結(jié)合作用力。

2.6 結(jié)合位置的確定

應(yīng)用Maciazek-Jurczyk M、劉保生、梁宏等[11-13]提出的方法，比較激發(fā)波長為280、295 nm 時(shí)CE-BSA 體系熒光程度的變化情況。CE-BSA體系的熒光猝滅曲線見圖6。

圖6 CE-BSA體系的熒光猝滅曲線Fig 6 Fluorescence quenching curves of CE-BSA system

由圖6 可知，280、295 nm 激發(fā)波長下，CE 對BSA 的猝滅程度曲線沒有重疊，說明色氨酸和酪氨酸殘基都參與其中。對比這兩種波長下的熒光猝滅程度可知，在280 nm 激發(fā)時(shí)降低程度更大些，這說明在CE 與BSA 的結(jié)合過程中，結(jié)合位點(diǎn)主要位于亞螺旋域ⅡA。

2.7 藥物協(xié)同性考察

Maciazek-Jurczyk M、劉保生、梁宏等[11-13]認(rèn)為藥物協(xié)同性是指藥物與具有多重結(jié)合部位的BSA 結(jié)合過程中各結(jié)合部位之間可能存在相互影響作用，可用Hill 方程進(jìn)行分析：lg[H/（1－H）]＝lgKH+nHlg[c]，式中，H為結(jié)合飽和分?jǐn)?shù)，KH為結(jié)合常數(shù)，nH為Hill 系數(shù)。在熒光試驗(yàn)中：H/（1－H）=B/（Bm－B），其中，B為（F0－F）/F0；1/Bm為1/B對1/[c]作圖的截距。不同溫度下CE-BSA體系的nH值結(jié)果見表5。

表5 不同溫度下CE-BSA體系的nH值Tab 5 The value of nHof CE-BSA system at different temperatures

由表5可知，3個(gè)溫度下的nH都略小于1，表現(xiàn)為弱的負(fù)協(xié)同作用，說明CE與BSA結(jié)合過程中，隨著配體CE不斷地結(jié)合到位點(diǎn)，使得后繼配體對BSA的親和性減弱，即前一個(gè)藥物分子結(jié)合到BSA位點(diǎn)上后，對后一個(gè)藥物分子與BSA的結(jié)合起到了阻礙作用。隨著溫度的變化，雖然nH變化不大，但也隨溫度升高而降低，說明溫度的提升對CE藥物小分子之間的協(xié)同作用不利。

2.8 CE對BSA構(gòu)象的影響

在Δλ＝15 nm 和Δλ＝60 nm 的條件下，測得CE-BSA 體系的同步熒光光譜見圖7。

圖7 CE猝滅BSA的同步熒光光譜圖Fig 7 Synchronous fluorescence spectrogram of CE quenching BSA

由圖7 可知，隨CE 濃度的增大，這兩種氨基酸殘基的λmax幾乎沒有發(fā)生移動(dòng)，說明CE的加入幾乎不對BSA 構(gòu)象產(chǎn)生影響[11-13]。酪氨酸的猝滅程度大于色氨酸，表明CE 與BSA 相結(jié)合的位點(diǎn)偏向于酪氨酸。

3 討論

用熒光光譜和紫外吸收光譜法推斷出CE 對BSA 熒光產(chǎn)生靜態(tài)猝滅，CE 和BSA 之間的作用力類型主要為靜電作用力；CE 與BSA 可形成1 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，表明CE 可被BSA 運(yùn)輸；nH＜1，表明CE 對結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)生負(fù)協(xié)同作用，即CE 加入使BSA 的親和性增強(qiáng)，有利于后續(xù)CE 與BSA 的結(jié)合，結(jié)合部位在BSA 的亞螺旋域ⅡA 中。同步熒光光譜表明CE 幾乎不對BSA 構(gòu)象產(chǎn)生影響，結(jié)合位點(diǎn)靠近酪氨酸殘基。該研究結(jié)果為了解CE 在體內(nèi)的運(yùn)輸和代謝過程、毒性機(jī)制提供了重要信息。

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