酮咯酸氨丁三醇眼用凝膠劑對兔金黃色葡萄球菌性角膜潰瘍的保護作用

胡 芳，徐婷君（1.嘉興市第二醫院眼科，浙江嘉興 314000；.平湖市第一人民醫院眼科，浙江 平湖 31400）

角膜潰瘍是一種臨床上常見的發病于眼球前層薄膜處的潰瘍性病變，其發病原因較多且極其復雜，除嚴重的外傷或者感染外，也可并發于結核或面癱等[1]。臨床上最為常見的類型主要為金黃色葡萄球菌性角膜潰瘍，顧名思義，其發病原因為金黃色葡萄球菌感染，隨后機體產生角膜浸潤和抗體反應；患者最為典型的癥狀為怕光、眼睛疼痛、結膜充血紅腫[2-3]。如果沒有得到及時科學的治療，嚴重者隨著潰瘍程度的加重，可嚴重損傷其眼角膜。因此，科學有效地針對金黃色葡萄球菌所致的角膜潰瘍進行治療顯得尤為重要[4]。酮咯酸氨丁三醇（Ketorolac tromethamine）屬非甾體類抗炎藥，可溶于水，有較好的局部滲透作用；配成水溶性滴眼液可抑制眼內組織前列腺素（PGs）的生物合成，明顯降低房水中的PGs 水平以及由PGs 引起的血-房水屏障破壞等炎癥反應，有效控制炎癥。其主要用于解除由過敏性結膜炎所致的眼部瘙癢、不適，具有消炎止痛作用[5]。本文針對金黃色葡萄球菌性角膜潰瘍，研究酮咯酸氨丁三醇眼用凝膠劑對兔金黃色葡萄球菌性角膜潰瘍的保護作用，現報道如下。

1 材料

1.1 儀器

BL-5000型裂隙燈顯微鏡（上海博覽光電儀器有限公司）；保溫箱（北京福意電器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

酮咯酸氨丁三醇眼用凝膠（沈陽興齊眼科股份有限公司，批號：20120510、20120511、20130512，規格：5 ml ∶600 mg、5 ml ∶400 mg、5 ml ∶200 mg）；鹽酸氯胺酮注射液（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號：H32022820，規格：2 ml ∶0.1 g）；鹽酸異丙嗪注射液（上海禾豐制藥有限公司，批號：H31022033，規格：2 ml ∶50 mg）；克拉霉素眼用凝膠（浙江亞太藥業股份有限公司，批號：H20058223，規格：5 ml ∶200 mg）；生理鹽水（天津藥業焦作有限公司，批號：H20044024，規格：10 ml∶90 mg）。

1.3 動物

1.4 菌株

金黃色葡萄球菌標準菌株（ATCC 25923）購自上海士鋒生物科技有限公司。

2 方法

2.1 細菌的培養

在金黃色葡萄球菌標準菌株上挑取單個菌落，在實驗開始的第1天將其接種于含胎牛血清的培養基上，隨后在保溫箱里進行培養，最后向所培養的菌株里加入生理鹽水，制備成菌懸液[6]。整個過程要注意無菌操作，保證菌種的單一性，同時控制菌懸液的細胞密度為3.0×109ml－1左右。

2.2 復制角膜潰瘍模型

采用角膜實質層接種法。分別將1 ml鹽酸氯胺酮注射液和1 ml鹽酸異丙嗪注射液混合后，sc給藥；待家兔達到全麻的效果后，將事先準備好的0.1 ml金黃色葡萄球菌懸液從角膜中央緩慢注入實質層，待角膜形成5.0 mm的混濁區時停止注射，即模型復制完畢。

2.3 分組與給藥

取100只家兔，分籠進行喂養，嚴格遵循喂養原則，按時給予充足的食物和水。本次實驗之前，所有家兔經裂隙燈顯微鏡觀察眼部情況，均顯示正常。實驗時，采用角膜實質層接種法復制金黃色葡萄球菌性角膜潰瘍家兔模型，并按照隨機數字表法將其分成模型（生理鹽水）組、陽性對照（克拉霉素眼用凝膠）組和凝膠劑高、中、低劑量（酮咯酸氨丁三醇眼用凝膠劑120、80、40 mg/ml）組，每組20只，保證各組的潰瘍面積大小無差異。每組家兔每日給藥1次，每次1滴，連續給藥2周。每次劑量嚴格按照研究要求進行，用藥部位為角膜潰瘍面。

2.4 觀察指標和療效評價標準

2.4.1 角膜評分 按照改進的McNeill 角膜病變程度分級法進行角膜評分[7]：0 分為角膜實質層清晰；1 分為角膜輕度水腫；2 分為角膜嚴重水腫；3 分為角膜明顯混濁；4 分為角膜嚴重水腫且前房積膿。

2.4.2 臨床療效評價 依據原衛生部頒布的《藥物臨床研究指導原則》，分為顯效、有效、無效3級。其中，顯效為潰瘍面積小于1 mm；有效為潰瘍面積2～5 mm；無效為潰瘍面積大于5 mm。總有效率＝（每組顯效例數+有效例數）/每組總數×100%。

2.5 視網膜觀察

于末次給藥后，顯微鏡觀察各組家兔的視網膜變化。具體病理切片制作步驟：將固定好的眼球取出，以摘除眼球時標記的打藥位置為中心矢狀切除兩旁組織，保留脈絡膜上腔注射位置兩邊各0.5 cm 寬的由角膜頂端至視神經孔的環狀結構。將切好的組織標本置于體積分數為70%、80%、85%、95%的乙醇中，分別脫水50 min，再以無水乙醇脫水3 次，各1 h。用二甲苯浸泡眼球30 min，使組織透明。將加熱溶解的石蠟（石蠟熔點為60 ℃左右）浸入組織各1 h，然后立即埋于石蠟中進行冷卻。制好的蠟塊放置于切片機上切片，切片貼附在載玻片上進行70 ℃烘烤1 h。將載玻片浸入二甲苯10 min、無水乙醇1 min 及95%、90%、85%乙醇各1 min 進行脫蠟，然后蒸餾水沖洗。將沖洗好的載玻片進行蘇木精-伊紅（HE）染色，染色后使用80%、95%、95%乙醇和無水乙醇分別清洗1 min，二甲苯清洗約2 min，中性樹脂膠封固，于顯微鏡下觀察視網膜變化。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 治療前后角膜評分比較

與模型組比較，陽性對照組和凝膠劑各劑量組家兔給藥后角膜潰瘍病變均有改善，角膜評分減小、總有效率增加，差異有統計學意義（P＜0.05），且凝膠劑高、中劑量組效果優于陽性對照組（P＜0.05）。各組家兔給藥前后角膜評分結果見表1，療效評價結果見表2。

3.2 組織結構

各組家兔均未發現視網血管異常擴張、視網膜下出血以及炎癥滲出等反應。這表明本實驗對視網膜無影響。各組家兔給藥后視網膜切片圖見圖1。

表1 各組家兔給藥前后角膜評分結果Tab 1 Keratopathy score of rabbits in each group before and after medication

表2 各組家兔給藥前后療效評價結果[例（%）]Tab 2 Therapeutic efficacy of rabbits in each group before and after medication[case（%）]

圖1 各組家兔給藥后視網膜切片圖（HE，×100）A.模型組；B.陽性對照組；C.凝膠劑高劑量組；D.凝膠劑中劑量組；E.凝膠劑低劑量組Fig 1 Retinal slice of rabbits in each group after medication（HE，×100）A.model group；B.positive control group；C.gel high-dose group；D.gel medium-dose group；E.gel low-dose group

4 討論

角膜潰瘍是臨床上常見的眼部疾病，多數情況下是由細菌引起的，特別是金黃色葡萄球菌，這主要由于金黃色葡萄球菌分布較廣和致病性較強，常常引發各種感染[8]。目前臨床上針對金黃色葡萄球菌所致的角膜潰瘍多采用抗生素類藥物進行治療，然而隨著藥物的長期應用，已出現明顯的耐藥性，因此臨床上有必要找到新的抗生素類藥物來對抗此類疾病。同時由于角膜潰瘍危害性之大、發病率之高，找到科學有效的治療藥物迫在眉睫[9]。本次實驗中針對家兔金黃色葡萄球菌性角膜潰瘍采用兩種方法進行治療，其中陽性對照組采用克拉霉素眼用凝膠進行治療。克拉霉素是一種在紅霉素的基礎上研制而成的大環內酯類抗生素，其抗菌范圍較廣，能夠應對各種適應證，且抗菌效果較好，已經在臨床上得到廣泛的應用[10]；然而，由于其水溶性較差，藥物吸收量較小，臨床治療效果并不明顯，應用于眼科治療時具有一定局限性。另一種方法是采用酮咯酸氨丁三醇眼用凝膠劑進行治療，其能夠在較短的時間內緩解和消除疼痛，通過抑制PGS的合成來發揮作用，在短期即可抵抗金黃色葡萄球菌所致的感染，并對潰瘍面進行修復，促進潰瘍的愈合，具有較好的臨床效果[11]。在本次實驗中，對5 組家兔治療前后角膜評分和療效進行比較，發現凝膠劑各劑量組家兔治療后角膜評分明顯低于治療前，且明顯低于陽性對照組，總有效率明顯高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

綜上所述，酮咯酸氨丁三醇眼用凝膠劑對兔金黃色葡萄球菌性角膜潰瘍有較為明顯的保護作用，既可有效減輕角膜病變，又可縮小角膜潰瘍面積，顯著提高治療有效率，為該藥臨床使用提供了實驗依據。

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[2]王冬梅，陳光勝，黃明漢.那他霉素在真菌性角膜潰瘍愈合中的治療作用[J].國際眼科雜志，2010，10（4）：744.

[3]孫毅，鮮依鲆，曾妮，等.真菌性角膜炎臨床轉歸與病理分析[J].眼科新進展，2012，32（2）：177.

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[5]張志杰.新型非甾體止痛藥：酮咯酸氨丁三醇（尼松）[J].中南藥學，2008，6（3）：372.

[6]周亞麗，許紅，唐汝，等.酮咯酸氨丁三醇聯合利多卡因用于婦科小手術鎮痛效果觀察[J].實用臨床醫藥雜志，2011，15（17）：52.

[7]李小林.酮咯氨酸丁三醇治療腎絞痛的療效觀察[J].中國醫藥導報，2011，8（5）：149.

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[11]丁剛，史偉云，李素霞，等.多層羊膜移植聯合免疫抑制劑治療早期淺中基質層蠶蝕性角膜潰瘍療效觀察[J].中國實用眼科雜志，2011，29（4）：353.