創傷后應激障礙對大鼠腸系膜和軟腦膜微循環的影響*

劉　蜜　宋丹丹　李玉珍　徐菲菲　陶天琪　李　冬　劉秀華　郭渝成

guoyucheng717@163.com

創傷后應激障礙對大鼠腸系膜和軟腦膜微循環的影響*

劉蜜宋丹丹李玉珍徐菲菲陶天琪李冬劉秀華郭渝成#

guoyucheng717@163.com

【摘要】目的：研究創傷后應激障礙 (PTSD) 大鼠腸系膜和軟腦膜微循環的改變及其機制。方法：成年健康雄性SD大鼠18只，隨機分為正常對照組 (n=6) 和PTSD組 (n=12)。采用單程延長刺激法復制PTSD大鼠模型，通過曠場實驗檢測大鼠的行為學改變；采用活體微循環觀測技術觀察大鼠腸系膜及軟腦膜微血管內徑和血流速度的改變；采用ELISA檢測大鼠血漿去甲腎上腺素 (NA)、內皮型一氧化氮合酶 (eNOS) 和內皮素-1 (ET-1)水平。結果：與正常對照組比較，PTSD組大鼠在曠場中穿行格數及直立次數顯著減少 (P<0.01)；腸系膜及軟腦膜細動脈、細靜脈管徑明顯變細(P<0.05)，血流速度趨緩；血漿NA和ET-1含量顯著升高 (P<0.01)，但eNOS水平無顯著變化 (P>0.05)。結論：PTSD大鼠存在腸系膜和軟腦膜微循環障礙。

【關鍵詞】創傷后應激障礙；腸系膜；軟腦膜；微循環；大鼠

Post-traumatic Stress Disorder on the Microcirculation of Mesentery and Cerebral Pia Mater in Rats

LIU Mi, SONG Dan-dan, LI Yu-zhen, XU Fei-fei, TAO Tian-qi, LI Dong, LIU Xiu-hua, GUO Yu-cheng#

Department of Pathophysiology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China；#Corresponding author

【Abstract】Objective: To investigate the effect of post-traumatic stress disorder (PTSD) on microcirculation of mesentery and cerebral pia mater in rats and the underlying mechanisms. Method: Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into two groups: control group (n=6) and PTSD group (n=12). The PTSD model was replicated by using the single prolonged stress method. On the 14th day post-stress, the changes of animals' behavior was evaluated via open-field; the microcirculation of mesentery and cerebral pia mater of rats was observed using the microscope; the plasma noradrenaline (NA), endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and endothelin-1 (ET-1) were measured by using enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).Results: Compared with the control rats, the numbers of crossing and rearing of the PTSD rats were decreased significantly in the open-field (P<0.01); the diameters of arteriole and veinule in the mesentery and cerebral pia mater from the PTSD rats were significantly thinner (P<0.05), the blood flow velocity showed the trend of slowed down; the plasma levels of NA and ET-1 were elevated significantly (P<0.01); there was no significant difference in the plasma level of eNOS (P>0.05).Conclusion: PTSD induces microcirculation dysfunction in mesentery and cerebral pia mater in rats.

【Key words】Post-traumatic stress disorder; Mesentery; Cerebral piamater; Microcirculation;Rat

創傷后應激障礙 (Post-traumatic Stress Disorder, PTSD) 指個體由于經歷對生命具有威脅的事件或嚴重創傷 (如戰爭、自然災害及性侵害等)，導致一系列精神癥狀長期存在的精神障礙，被認為是心血管疾病的獨立危險因素[1-3]；微循環是心血管系統的重要組成部分，微循環障礙與心血管疾病的發生、發展和預后密切相關。PTSD與微循環的關系已受到臨床應用研究的關注。

血管內皮損傷及功能障礙是心血管病的始動環節之一[4]。心理應激及精神抑郁可能導致內皮功能障礙，從而介導心身疾病的病理生理過程，包括微循環障礙。已有研究表明，來自工作及生活的壓力可使內皮標志分子血管細胞黏附因子-1和可溶性細胞間黏附因子-1血漿水平顯著增加[5]；以及抑郁癥患者肱動脈血流介導性舒張功能降低[6]。但有關PTSD是否通過損傷血管內皮引起微循環障礙的直接證據尚未見報道。

本研究采用單程延長刺激 (Single Prolonged Stress, SPS)法模擬PTSD[7, 8]，活體觀察實驗大鼠自發性活動的行為學特征；活體觀測腸系膜、軟腦膜微血管內徑和血流速度變化及離體血液中去甲腎上腺素 (Noradrenaline, NA)、內皮型一氧化氮合酶 (Endothelial Nitric Oxide Synthase, eNOS) 和內皮素-1 (Endothelin-1, ET-1) 水平，初步探討PTSD對大鼠微循環的影響及其作用機制。

1材料與方法

1.1　實驗動物

成年雄性SD大鼠18只，體重200-250g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。光亮/黑暗周期為12h/12h，光照時間7∶00-19∶00，環境溫度為22-24℃，相對濕度50%-60%。實驗前適應性喂養1周，6只/籠，自由攝食飲水。

1.2　器材與試劑

自制曠場實驗箱(由底面為80cm×80cm、高50cm，四壁光滑的不透明塑料板制成，底面被劃分成為16個20cm×20cm的等邊方格)用于觀察實驗大鼠的自發性活動情況；自制恒溫微循環觀測盒；Olympus BH-2微循環顯微鏡購自日本Olympus公司；微循環圖像分析系統購自徐州眾聯醫療器械有限公司；NA檢測試劑盒(批號：H20150407)、eNOS檢測試劑盒(批號：H20150408)、ET-1檢測試劑盒(批號：H20150409)均為南京建成生物工程研究所產品；Infinite?F200 PRO多功能酶標儀為瑞士TECAN公司產品。

1.3　實驗分組與PTSD處理

實驗大鼠按照隨機數字表完全隨機化分為正常對照組(Control組，n=6)和PTSD組(n=12)，Control組大鼠常規飼養，不作任何處理。PTSD組大鼠模擬PTSD：先將大鼠置于圓錐形聚乙烯固定器中固定2h(僅尾巴可以活動)，強迫其游泳20min(游泳池長50cm，寬40cm，高60cm，水深40cm，水溫24℃，每次6只)；休息15min后，將大鼠放入下層盛有100%乙醚的干燥器中麻醉(約3-5min)，取出待其自然清醒后，放回籠中無干擾常規飼養2周。

1.4　曠場實驗及自發活動指標

模擬PTSD后第14天，參照文獻[9]方法，在暗光、無噪聲環境下，將兩組大鼠依次置于曠場實驗箱中，用攝像頭監視大鼠活動情況，10s適應后，采集5min視頻資料記錄其穿行格數(三爪以上跨入臨格的次數)和直立次數(兩前爪騰空1cm以上或攀附墻壁次數)。

1.5　微循環觀測

為降低工作量，PTSD組樣本含量為9時已滿足實驗所需，故PTSD組只隨機選擇9只大鼠進行微循環觀測。

1.5.1腸系膜微循環觀測：兩組大鼠完成曠場實驗后禁食12h，以20%烏拉坦肌肉注射(0.8ml/100g)麻醉，取仰臥位固定于手術臺上，于腹部正中作一長2cm縱行切口，輕輕牽出一段空腸，將腸系膜平鋪于37℃恒溫透明微循環觀察盒中并放置于微循環顯微鏡載物臺上，保持濕潤(不時滴加37℃生理鹽水)，采用高壓汞燈光源和微循環顯微鏡觀測系統觀測腸系膜微血管并錄像。在微循環圖像分析系統中回放錄像，在顯示器上對細靜脈和細動脈內徑進行測量；之后選擇細靜脈，采用陰極射線管群點掃描法，先調節光點使之與血管平行并順血流方向連續掃描，再調節其掃描速度與血流速度同步，記錄血流速度。

1.5.2軟腦膜微循環觀測：腸系膜微循環觀測完成后俯臥位固定大鼠，剪開頭頂部正中皮膚，暴露顱骨，以矢狀縫右3mm和冠狀縫后3mm交叉點為中心，用牙科電鉆打孔開顱窗(直徑5mm)，小心剪開硬腦膜，暴露軟腦膜，以37℃人工腦脊液棉球覆蓋保溫、保濕。同腸系膜觀測方法觀察記錄軟腦膜微血管內徑及血流速度。

1.6　血漿NA、eNOS和ET-1水平檢測

完成微循環檢測后腹主動脈采血5ml置于檸檬酸鈉抗凝試管中，3 000rpm離心15min，分離血漿于-80℃冰箱凍存，按照試劑盒說明書集中檢測血漿NA、eNOS和ET-1水平。

1.7　統計學處理

2結果

2.1　兩組大鼠自發活動指標比較

與Control組比較，PTSD組大鼠穿行格數及直立次數均顯著減少(P<0.01)，見表1。

表1　兩組大鼠自發活動指標比較±s)

注：與Control組比較，1)P<0.01

2.2　兩組大鼠腸系膜及軟腦膜微循環指標比較

Control組大鼠腸系膜及軟腦膜微血管清晰，細動脈血流速度快，呈線流，細靜脈呈線流或線粒流，未見紅細胞聚集；PTSD組大鼠腸系膜及軟腦膜細動、靜脈管徑顯著變細，腸系膜細靜脈血流速度減慢，紅細胞聚集明顯。見圖1。

2.2.1兩組大鼠腸系膜和軟腦膜微血管管徑：與Control組比較，PTSD組大鼠腸系膜和軟腦膜細靜脈、細動脈均明顯變細，差異有統計學意義 (P<0.05或P<0.01)，見表2。

2.2.2兩組大鼠細靜脈血流速度：與Control組比較，PTSD組大鼠腸系膜和軟腦膜的細靜脈血流速度均有減慢趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表2　兩組大鼠腸系膜及軟腦膜微血管管徑比較 (μm, ±s)

注：與Control組比較，1)P<0.05，2)P<0.01

表3　兩組大鼠細靜脈血流速度比較

2.3　兩組大鼠血漿NA、eNOS及ET-1含量比較

與Control組比較，PTSD組血漿NA和ET-1含量升高，差異有統計學意義(P<0.01)；兩組間eNOS水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4　兩組大鼠血漿NA、eNOS及ET-1含量

注：與Control組比較，1)P<0.01

[本文圖1見插3]

3討論

PTSD是一種災害后精神及行為障礙，具有發病率高、病程長等特點，還會直接導致冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等的發生。因其交感神經-腎上腺髓質系統持續性激活，使兒茶酚胺等持續增高，導致基礎心率加快和血壓升高[10, 11]。本研究通過SPS法模擬大鼠PTSD，采用曠場實驗、微循環檢查和血管活性指標分析，獲得了PTSD大鼠微循環變化特點及其機制的有意義數據和結果，為臨床應用研究提供了實驗依據。

微循環是機體組織血流灌注的基本單位，又是最易損傷和發生功能障礙的特殊器官。腸系膜微循環可以反映全身微循環狀況，軟腦膜微循環是腦血管床的一部分，其管徑及血流狀態可基本反映腦微循環變化。本研究觀測發現，PTSD大鼠腸系膜及軟腦膜細動、靜脈均較正常對照大鼠顯著收縮，且血流速度減慢，腸系膜微血管內可見紅細胞聚集。提示PTSD可引起大鼠腸系膜和軟腦膜微循環障礙。

NA主要來自腎上腺髓質，可激活交感-腎上腺髓質系統，通過激動α受體引起腸系膜微血管收縮[12]。本研究發現，PTSD大鼠血漿NA水平升高與微血管收縮同時出現，表明高水平NA可能與PTSD大鼠腸系膜及軟腦膜微血管收縮有關。

血管內皮產生的旁、自分泌物ET-1也是強烈的縮血管活性肽，廣泛存在于各種組織和細胞中。尤以內皮細胞受損時合成、分泌增加[13]。謝忠明等[14]研究證實高黏血癥模型兔軟腦膜微血管收縮與血漿ET-1 升高有明顯相關性；本實驗也發現血漿ET-1水平升高的PTSD大鼠腸系膜及軟腦膜微血管管徑較正常對照大鼠變細。進一步提示血漿ET-1水平增加與NA水平升高一樣，是PTSD大鼠微血管收縮的可能機制。eNOS增加可致一氧化氮 (NO) 水平升高，NO作為血管內皮合成、分泌的最重要的血管活性物質，具有舒張血管、抗血小板聚集、抗血管平滑肌細胞增生等作用[15]。但在本研究中未能發現PTSD大鼠血漿eNOS水平升高，即PTSD大鼠的血管舒張彈性較小。

綜上所述，PTSD大鼠腸系膜和軟腦膜微循環存在不同程度損害，這種微循環損害機制與其血漿NA及ET-1濃度增加有關。

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劉蜜 (1985-)，女，漢族，博士，主要從事創傷后應激障礙相關心血管疾病的研究

參考文獻

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作者簡介：本文第一

[中圖分類號]R331.3+5

[文獻標識碼]A

[文章編號]1005-1740(2015)04-0011-04

doi：10．3969／j．issn．1005－1740．2015．04．003

*[基金項目]“十二五”國家科技支撐計劃項目 (2013BA108B01)；中國博士后基金 (2014M562608)

本文2015-04-30收到，2015-09-21修回

微循環學雜志，2015，25（4）：11－14

?2015 CHINESE JOURNAL OF MICROCIRCULATION