成人股骨頭缺血性壞死中轉化生長因子與血管內皮因子的表達研究

何志明

臨床醫學

成人股骨頭缺血性壞死中轉化生長因子與血管內皮因子的表達研究

何志明

目的通過對壞死股骨頭進行轉化生長因子及血管內皮因子的檢驗, 更深入地掌握股骨頭缺血性壞死的發生進展規律, 更深入地探討股骨頭缺血性壞死的分子生物學基礎。方法采集30例髖關節置換手術患者的股骨頭作為標本,15例股骨頭缺血性壞死的病例作為試驗組,15例股骨頸囊內骨折的病例作為對照組。將標本送實驗室行免疫組織化學技術檢驗, 即抗原與抗體特異性結合的原理,通過化學反應使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內抗原(多肽和蛋白質), 對其進行定位、定性及定量的研究。結果對照組壞死區及其周圍區域均有轉化生長因子與血管內皮因子的陽性表達, 本實驗中股骨頭缺血性壞死區表達最少, 對照組表達居中, 股骨頭缺血性壞死周圍區表達最多。結論①轉化生長因子及血管內皮因子在股骨頭缺血性壞死周圍區的表達明顯增強, 說明股骨頭缺血性壞死周圍區局部有良好的修復力, 在股骨頭缺血性壞死病理形成中起著非常重要的作用, 與新骨的形成以及肉芽組織與纖維組織大量增生有關。②轉化生長因子及血管內皮因子在股骨頭缺血性壞死區表達不足, 與壞死骨修復的失敗有非常密切的關系, 說明該區缺少修復活動能力。

股骨頭缺血性壞死；轉化生長因子；血管內皮因子；免疫組織化學技術；組織病理學

轉化生長因子屬于一個超級家族的相關蛋白成員, 轉化生長因子在骨組織、血小板、軟骨中含量豐富。骨的形成、生長、壞死后的修復均與轉化生長因子有著密切關系[1]。轉化生長因子在骨痂形成與塑形中起著重要作用[2]。骨母細胞和軟骨細胞富含轉化生長因子受體, 轉化生長因子已被證實能夠刺激軟骨內化骨。各種基礎研究證實[3], 轉化生長因子在不同的效應細胞中也表現出不同效應, 具有雙向調節性。在發生組織損傷后轉化生長因子在修復進程中起著非常重要的作用。如果轉化生長因子過量表達就會出現肉芽組織過度增生甚至慢性纖維化。血管內皮因子與多種組織器官肉芽組織過度增生、纖維化也有密切的關系。目前關于成人股骨頭缺血性壞死轉化生長因子或血管內皮因子方面的研究報道還很少[4]。通過對壞死股骨頭進行轉化生長因子及血管內皮因子的檢驗, 可以更準確地認識股骨頭發生缺血性壞死的發展規律, 對于進一步深入探討股骨頭發生缺血性壞死的分子生物學基礎是有益的, 也能夠為臨床進行股骨頭缺血性壞死的治療提供一定的方向[5]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 實驗用的股骨頭標本都是來自佛山市三水區人民醫院骨科行髖關節置換手術患者, 共30例, 其中女12例, 男18例, 實驗室檢查類風濕因子陰性, 抗O抗體＜500單位, 血常規及血沉都正常。15例股骨頭缺血性壞死者作為試驗組,15例股骨頸囊內骨折者作為對照組, 試驗組中女9例, 男6例, 年齡25～60歲, 平均年齡48.2歲, 主要表現為：患側髖部疼痛(可有靜息痛), 活動后加劇, 患者髖關節活動受限, X光影像學表現為股骨頭發生扁平甚至塌陷。對照組中女3例, 男12例, 年齡59～98歲, 平均年齡68.5歲, 來源為因外傷行髖關節置換的手術者, 手術均在7 d內完成, 受傷前無髖關節疼痛、活動受限等癥狀, 檢查未發現股骨頭缺血性壞死的醫學證據。

1.2 主要儀器與試劑 低溫超速離心機, 烤箱, 自動照相顯微鏡, 低溫冰箱, 轉化生長因子及血管內皮因子免疫組織化學技術試劑盒, 烘片機, 恒低溫冰凍切片機, 全自動組織脫水機, 攤片機, 超低溫冰箱。

1.3 方法 試驗組標本是手術病例切除的股骨頭, 在切出時立即選取5 mm×5 mm大小的壞死中心骨組織和壞死周邊骨組織各1塊, 吸干血跡, 馬上浸入濃度為4％的福爾馬林液中, 保存在4℃冰箱內。標本經濃度為4％福爾馬林液固定。對照組則取相應部位骨組織。用上述方法制作5 μg冰凍切片,做免疫組織化學技術染色。免疫組織化學技術是利用抗原與抗體特異性結合的原理, 通過化學反應使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內抗原(多肽和蛋白質), 對其進行定位、定性及定量的研究。

1.4 操作流程 ①脫鈣, 標本脫水；②透明；③浸蠟, 包埋；④切片；⑤烤箱加熱；⑥免疫組織化學技術染色；⑦滅活內源性酶；⑧加滴封閉；⑨稀釋；⑩滴加生物素化；?滴加試劑SABC；?顯色；?復染；?脫水；?二甲苯洗滌；?樹膠封片；?微鏡鏡檢。

1.5 免疫組織化學技術染色結果觀察 positive reaction呈淺黃色至深棕黃色顆粒狀, 無positive reaction為陰性(-)。淺黃色(+), 黃色(++), 深黃色(+++)。為評估轉化生長因子與血管內皮因子免疫染色細胞的數量, 在呈positive reaction病例中,每例隨機進行鏡下檢查10個不同視野累計200個細胞計數相應免疫染色的百分率[6]。

1.6 統計學方法 采用SPSS13.0統計學軟件對數據進行分析處理。計量資料以均數±標準差(±s)表示, 采用t檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 轉化生長因子在試驗組股骨頭缺血性壞死區較低, 與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05), 血管內皮因子在試驗組股骨頭缺血性壞死區較低, 與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 轉化生長因子與血管內皮因子在試驗組壞死區與對照組的表達情況(±s)

表1 轉化生長因子與血管內皮因子在試驗組壞死區與對照組的表達情況(±s)

注：與對照組比較,aP＜0.05

組別 例數 轉化生長因子 血管內皮因子試驗組(壞死區) 15 12.89±4.01a 11.29±1.56a對照組 15 18.56±3.25 16.78±1.42

2.2 轉化生長因子在試驗組股骨頭缺血性壞死周圍區較高,與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05), 血管內皮因子在試驗組股骨頭缺血性壞死周圍區亦較高, 與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 轉化生長因子與血管內皮因子在試驗組壞死周圍區與對照組的表達情況(±s)

表2 轉化生長因子與血管內皮因子在試驗組壞死周圍區與對照組的表達情況(±s)

注：與對照組比較,aP＜0.05

組別 例數 轉化生長因子 血管內皮因子試驗組(周圍區) 15 26.89±2.23a 38.29±3.15a對照組 15 18.56±3.25 16.78±1.42

2.3 轉化生長因子在試驗組股骨頭缺血性壞死周圍區較高,與壞死區比較差異有統計學意義(P＜0.05), 血管內皮因子在試驗組股骨頭缺血性壞死周圍區較高, 與壞死區比較差異有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

表3 轉化生長因子與血管內皮因子在試驗組病理壞死區與病理周圍區表達情況(±s)

表3 轉化生長因子與血管內皮因子在試驗組病理壞死區與病理周圍區表達情況(±s)

注：與病理壞死區比較,aP＜0.05

分區 例數 轉化生長因子 血管內皮因子病理壞死區 15 12.89±4.01 11.29±1.56病理周圍區 15 26.89±2.23a 38.29±3.15a

3 討論

股骨頭缺血性壞死在缺血壞死的早期, 還沒有發生明顯影像學改變時, 已有骨損傷(鏡下骨折等), 因此, 局部的分子必然會啟動一個骨折修復程序, 但是如何啟動并不清楚。實驗表明在周圍區轉化生長因子與血管內皮因子為高表達,而在壞死區則為低表達, 增加轉化生長因子與血管內皮因子的表達應該能促進修復的進度[7]。假設股骨頭缺血性壞死在缺血壞死早期進行人為的干預, 增加轉化生長因子與血管內皮因子的表達, 促進修復進度, 使修復快于壞死, 也許能夠治愈股骨頭缺血性壞死。目前已有大量的轉化生長因子與血管內皮因子針對如何進行組織的修復和組織的纖維化相關性治療嘗試, 對于股骨頭缺血性壞死的防治有很好的啟迪作用[8], 本課題有關的分子生物學研究結果, 不僅對以后繼續深入探討打下基礎, 也為針對股骨頭缺血性壞死治療的分子介入治療提出了另一個問題：如何防止轉化生長因子與血管內皮因子的過度表達造成大量纖維組織與肉芽組織增生乃至瘢痕化從而導致新骨形成障礙的不良后果。

[1]Mont MA, Einhorn TA, Sponseller PD, et al. The trapdoor procedure using autogenous cortical and cancellous bone grafts for osteonecrosis of he femoral head. J Bone Joint Surg(Br),1998,80(1):56-62.

[2]Breibart AS, Grande DA, Kessler R, et al. Tissue engineering bone re-pair of calvarial defects using cultured periosteal cells. Plastic Reconstr Surg,1998,101(3):567.

[3]王坤正, 同志勤, 王春生, 等.吻合血管游離腓骨移植治療股骨頭缺血性壞死.中華顯微外科雜志,2000,23(4):254-256.

[4]黃克勤.實用股骨頭缺血性壞死診治.北京:人民衛生出版社,1999:126.

[5]林喬齡, 張嵩圖, 陳聯源, 等.股骨頭缺血壞死發病機理的病理研究.中國骨傷,2001,14(3):150-151.

[6]張會生, 賈衛斗.非創傷性股骨頭缺血性壞死免疫組織化學技術與病理改變研究.張家口醫學院學報,2003,20(1):19.

[7]孫建, 龐清江.股骨頭血供及股骨頸骨折血管破壞研究進展.現代實用醫學,2006,18(3):203-209.

[8]李喜東, 范力軍, 李國力, 等.介入治療股骨頭激素性壞死的實驗研究.中華放射學雜志,1998,32(1):32-35.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.07.012

2014-12-12]

廣東省佛山市醫學科研立項(項目編號：2013448)

528100 廣東省佛山市三水區人民醫院