不同培養液對鼠胚在新建試管嬰兒實驗室中體外發育的影響

饒金鵬 劉青 錢小紅 魏凱 陳劍 金敏 金帆

不同培養液對鼠胚在新建試管嬰兒實驗室中體外發育的影響

饒金鵬 劉青 錢小紅 魏凱 陳劍 金敏 金帆

目的利用三種不同的培養液EBSS(SIGMA系列), G1和G2(Vitrolife系列), Quinn’s1026和Quinn’s1029(SAGE系列)對昆明系小白鼠胚胎進行體外培養, 以對新建IVF實驗室進行評估。方法取7周齡的昆明白雌性小鼠, 用人絕經期促性腺激素(HMG)10 IU促排卵,48 h后注射人絨毛促性腺激素(HCG)10 IU促卵泡成熟, 同時與雄性小鼠1：1合籠, 再經過48 h后獲取形態正常的2細胞鼠胚。將胚胎分成三組, A組使用EBSS(Earle’s Balanced Salt Solution)培養液, B組使用G1和G2培養液, C組使用Quinn’s1026和Quinn’s1029培養液, 三種培養液均添加10％人血清白蛋白。分析對比三組結果。結果72 h后, 鼠胚總體囊胚形成率為71.54％(382/534), 其中A組的囊胚形成率為30.56％(22/72), B組為70.49％(129/183), C組為82.80％(231/279), B、C組的囊胚形成率顯著高于A組(P＜0.01)。結論通過鼠胚體外培養, 對新建試管嬰兒實驗室進行了較好的質控檢測, 序貫培養液Vitrolife 系列的G1和G2以及SAGE系列的Quinn’s1026和Quinn’s1029在鼠胚囊胚形成率上要高于簡單培養液EBSS。

培養液；鼠胚；囊胚；體外培養；質量控制

自1985年Ackerman等首先用2細胞鼠胚來對實驗室進行質量控制(quality control, QC), 鼠胚實驗(mouse embryo assay, EMA)已成為生殖醫學中心胚胎培養室質量評估, 尤其是培養液質量檢測最為廣泛應用的方法[1]。而培養液對體外胚胎培養的重要性是不言而喻的, 一種優化的培養系統可以支持胚胎在體外或移植后形成囊胚并繼而發育成胎兒[1,2]。旨在對新建IVF胚胎培養室進行質量控制, 同時對培養液進行評估, 在為將來開展人類胚胎體外培養時培養液的選擇使用上積累實驗數據, 本院生殖中心2014年9～12月使用3種不同培養液對昆明系小白鼠進行胚胎體外培養, 并對比分析了3個不同組別之間的4細胞胚胎、8細胞胚胎、融合胚以及囊胚形成率。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物7周齡雌性昆明系小白鼠(體質量30～35 g),10周齡雄性小鼠(體質量35～40 g), 均購自浙江中醫藥大學實驗動物中心, 雌雄分籠飼養。

1.1.2 藥物與試劑 尿促性素(HCG)與絨促性素(HMG)均購自麗珠制藥廠。簡單培養液EBSS購自SIGMA公司, 序貫培養液G1和G2以及配子處理液G-GAMETE購自Vitrolife公司, 序貫培養液Quinn’s1026和Quinn’s1029, 人血清白蛋白(HSA)以及石蠟油均購自SAGE公司。培養液均添加10％HAS, 表面覆油后置于37℃,6.0％培養箱中平衡過夜。

1.1.3 耗材與設備35 mm培養皿及巴斯德管均購自美國FALCON公司, CO2氣體純度為99.999％, 丹麥IVFTECH工作站, 日本OLYMPUS解剖顯微鏡, 美國THEMRO培養箱, 德國LABTECH CO2濃度檢測儀, 美國SIGMA培養箱專用溫度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 鼠胚獲取與培養 雌鼠腹腔注射10 IU的HMG,48 h后再注射HCG, 注射后立即將雌雄按1∶1的比例合籠,48 h后取胚。將孕鼠頸椎脫臼處死后用眼科剪取輸卵管放于覆油的G-GAMETE配子處理液中, 用1 ml注射器針頭將輸卵管切割數次, 擠出胚胎, 再用拉細的巴斯德管將2細胞鼠胚收集并隨機分裝到覆油的3種不同培養液中, 并置于培養箱中培養[3,4]。當胚胎培養到8細胞階段, A組將胚胎轉移到新配制并于前1 d過夜平衡后的EBSS培養液, B、C組則分別將胚胎從G1和Quinn’s1026培養液中轉移到經過夜平衡后的G2和Quinn’s1029培養液中繼續培養。

1.2.2 鼠胚的觀察 觀察并記錄24 h后4細胞胚胎形成率,48 h后8細胞或融合胚形成率,72 h后囊胚形成率。

1.3 統計學方法 采用SPSS19.0統計學軟件對數據進行統計分析。計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

在2014年9～12月本院新建IVF胚胎實驗室共進行7個周期的鼠胚體外培養實驗, 累計獲取2細胞胚胎534枚,其中形成囊胚382枚, 總體囊胚形成率為71.54％。鼠胚培養分成3個組別進行, A組使用EBSS(Earle’s Balanced Salt Solution)簡單培養液, 在所獲得的72枚2細胞胚胎中共有22枚最終發育成囊胚, 囊胚形成率為30.56％；B組使用G1和G2序貫培養液,183枚2細胞胚胎中,129枚發育成囊胚,形成率為70.49％；C組使用Quinn’s1026和Quinn’s1029序貫培養液, 所得279枚胚胎中有231枚發育到囊胚階段, 其形成率為82.80％。B組和C組的囊胚形成率顯著高于A組(P＜0.01), 三組的胚胎發育情況及囊胚形成率, 見表1。鼠胚于覆油35 mm皿中體外培養不同時期的生長情況, 見圖1。

表1 不同培養液對鼠胚發育在各個分裂階段的影響(n, ％)

圖12 -細胞鼠胚于35 mm培養皿覆油培養的發育圖

3 討論

實驗室質控對試管嬰兒結局有重要影響。體外一系列因素如溫度、濕度、塵埃、揮發性有機物(VOC)、震動、噪音、光照、CO2濃度、pH、滲透壓等都會對不具備任何屏障和保護功能的胚胎產生影響[1]。因此, 建立穩定可靠的試管嬰兒實驗室, 為胚胎發育提供相對穩定的場所, 維持試管嬰兒成功率顯得尤為重要。而在諸多影響胚胎發育的因素中, 培養液是直接和胚胎接觸的介質, 同時也是實驗室最常用及最重要的消耗品, 其穩定性直接決定著胚胎培養的結局。小鼠胚胎生物檢測(MEA)是目前廣泛用于新建或新啟動周期的試管嬰兒實驗室的質控方法, 尤其在評估培養液的質量上發揮重要作用。

為了檢測新建試管嬰兒胚胎培養室是否達到人類胚胎培養標準, 同時為今后開展試管嬰兒胚胎體外培養在培養液的選擇使用上積累實驗數據, 本院生殖中心2014年9～12月,分別用EBSS, G1/G2, Quinn’s1026/1029對小鼠胚胎進行了體外培養, 并進行了對比分析。鼠胚發育的結果顯示, 在囊胚形成率上, 使用序貫培養液G1/G2, Quinn’s1026/1029進行培養的鼠胚的囊胚形成率(70.49％,82.80％)要顯著高于使用簡單培養液EBSS的囊胚形成率(30.56％)。而在胚胎發育過程中,作者發現使用簡單培養液EBSS進行培養的胚胎在發育到4-5細胞階段發生了較為嚴重的阻滯,24 h后4-5細胞的形成率為51.39％(37/72), 而發育到囊胚階段僅有30.56％(22/72), 而使用序貫培養液的胚胎則未發生此種現象。這可能是因為序貫培養液應對胚胎在卵裂早期和晚期對能量物質和氨基酸在需求上的不同做了成分上的調整, 從而使得胚胎在代謝活動相對較弱的早期和代謝活動相當活躍的囊胚階段都得到了合適的物質及能量支持, 如在卵裂階段, G1/G2, Quinn’s1026/1029均不含必須氨基酸, 但到了囊胚階段必須氨基酸的含量則遠高于非必須氨基酸的含量, 而簡單培養液的一個很大的不足是其不含氨基酸等復合成分, 使得其不能對胚胎發育階段的改變做出調整, 致使胚胎發育停滯在4-5細胞階段。而在兩種序貫培養液之間的比對上, 作者發現同樣添加10％人血清白蛋白HSA后, 在囊胚的形成率上使用SAGE系列的Quinn’s1026/1029(82.80％)要高于使用Vitrolife系列的G1/ G2(70.49％), 而美國梅奧醫學中心的Morbeck等[5,6]最近在Fertility and Sterility的研究報告顯示添加HSA的SAGE系列序貫培養液的鼠胚囊胚形成率(75％)反而略低于添加HSA的Vitrolife系列序貫培養液的培養結果(78％)。G1/G2和Quinn’s1026/1029在葡萄糖、有機酸、乳酸、丙酮酸、氨基酸、金屬離子和無機鹽等成分的比例上都存在一定的差異,會對胚胎培養產生不同的影響。與此同時, 不同的小鼠種系,促排卵藥物的種類與劑量以及培養環境、培養油、培養用器皿、培養箱、培養方法和操作過程都有可能對胚胎的發育結局產生影響。而培養液在小鼠胚胎體外培養的效果也不完全等同于其他種系胚胎培養的效果。但通過本次實驗, 更加確定了序貫培養液G1/G2和Quinn’s1026/1029在鼠胚體外培養效果上要優于早期簡單培養液EBSS, 實驗同樣豐富了對兩種序貫培養液G1/G2和Quinn’s1026/1029的認識。

[1]黃國寧, 孫海翔.體外受精-胚胎移植實驗室技術. 北京: 人民衛生出版社,2012:15 -37.

[2]黃國寧, 劉東云, 韓偉.輔助生殖技術實驗室的建設及其質量控制.中國實用婦科與產科雜志,2010,26(10):755-758.

[3]王利紅, 連方.兩種2-細胞鼠胚體外培養方法比較.中國比較醫學雜志,2009,19(11):67-69.

[4]孫新明, 魏泓, 趙永聚, 等. 昆明小鼠成熟卵母細胞體外授精及受精卵體外培養的研究. 中國比較醫學雜志,2005,15(3):129-132.

[5]Morbeck DE. Importance of supply integrity for in vitro fertilization and embryo culture. Semin Reprod Med,2012,30(3):182-190.

[6]Morbeck DE, Krisher RL, Herrick JR, et al. Composition of commercial media used for human embryo culture. Fertil Steril,2014,102(3):759-766.

Influence of different culture solutions on ectogenesis of mouse embryo in newly constructed in vitro fertilization laboratory

RAO Jin-peng, LIU Qing, QIAN Xiao-hong, et al. Reproductive Medicine Center, The Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou310052, China

ObjectiveTo implement three different culture solutions, as EBSS (SIGMA series), G1 and G2 (Vitrolife series), Quinn’s1026 and Quinn’s1029 (SAGE series), for In vitro culture of Kunming species mouse, in order to evaluate newly constructed IVF laboratory.MethodsFemale mice aged7 weeks were selected to receive human menopausal gonadotropin (HMG)10 IU for ovulation. Human chorionic gonadotropin (HCG)10 IU was injected after48 h for follicle maturity in1:1 cage mate with male mice. After another48 h, normal mouse embryos with2 cells were taken. They were divided into3 groups. Group A received Earle’s balanced saltsolution (EBSS), group B received G1 and G2 solution, and group C received Quinn’s1026 and Quinn’s1029 solution. All solutions contained10％ human serum albumin. Comparison and analysis were made on the results of the three groups.ResultsAfter72 h, the general blastulation rate of mouse embryo was71.54％ (382/534). The blastulation rate of group A was30.56％ (22/72), that of group B was70.49％ (129/183), and that of group C was82.80％ (231/279). Group B and group C had much higher blastulation rate than group A (P＜0.01).ConclusionThe in vitro culture of mouse embryo provides good quality control for the newly constructed IVF laboratory. G1 and G2 in sequential culture Vitrolife and Quinn’s1026 and Quinn’s1029 in SAGE have higher blastulation rate than single EBSS solution.

Culture solution; Mouse embryo; Blastosphere; In vitro culture; Quality control

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.07.197

2015-01-04]

國家自然科學基金資助課題(項目編號：81370760)

310052 浙江大學醫學院附屬第二醫院生殖醫學中心(饒金鵬 劉青 錢小紅 魏凱 陳劍 金敏)；浙江大學醫學院附屬婦產科醫院(金帆)