人參皂苷Rg3誘導乳腺癌MCF7Adr細胞凋亡的作用及其可能的分子機制

張　立

(武漢大學人民醫院藥品試劑供應科，武漢 430060)

?

人參皂苷Rg3誘導乳腺癌MCF7Adr細胞凋亡的作用及其可能的分子機制

張立

(武漢大學人民醫院藥品試劑供應科，武漢 430060)

摘要：目的研究人參皂苷Rg3誘導乳腺癌MCF7Adr細胞凋亡的作用及其可能的分子機制。方法培養乳腺癌MCF7Adr細胞，分為不含胎牛血清和藥物培養基處理的對照組以及100、200、400、800 μmol/L人參皂苷Rg3處理的處理組。采用噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖情況，Western-blot方法檢測細胞周期蛋白E(Cyclin E)、細胞分裂周期蛋白25A(CDC25A)水平。結果100 μmol/L人參皂苷組、200 μmol/L人參皂苷組、400 μmol/L人參皂苷組、800 μmol/L人參皂苷組的MTT值、Cyclin E、CDC25A蛋白水平均低于對照組[(76.4±16.4)、(56.3±11.5)、(35.2±6.9)、(20.4±4.2)比(100.0±19.5)；(84.3±16.1)、(60.5±12.1)、(39.1±5.2)、(24.5±3.9)比(100.0±18.5)；(79.5±14.8)、(59.1±10.9)、(35.4±6.1)、(22.7±4.2)比(100.0±18.5)]，差異均有統計學意義(均P<0.01)。；MTT值與Cyclin E、CDC25A蛋白水平呈正相關(P<0.05)。結論人參皂苷Rg3能劑量依賴性地誘導乳腺癌MCF7Adr細胞凋亡，且這一作用是通過抑制Cyclin E、CDC25A的表達來發揮的。

關鍵詞：乳腺癌；人參皂苷Rg3；凋亡；細胞周期蛋白E

乳腺癌是女性發病率最高的惡性腫瘤，在臨床治療時多采用手術切除、化療、生物治療等綜合療法。常規的化療藥物具有較強的不良反應，且容易產生抗藥性，整體的化療效果并不理想。近年來，臨床學者致力于探究具有抗腫瘤作用的天然化合物，從人參根中提取的人參皂苷單體是具有抗腫瘤作用的純天然化合物。本研究主要分析人參皂苷Rg3誘導乳腺癌MCF7Adr細胞凋亡的作用，并對其可能的分子機制進行探究。

1材料與方法

1.1材料乳腺癌細胞系MCF7Adr購買于中國科學院細胞庫；杜爾伯科極限必需培養基(Dulbecco minimum essential medium，DMEM)培養基和胎牛血清均購買于美國Sigma公司；抗體購買于英國Abcam公司；離心管和細胞培養板購買于美國Corning 公司；人參皂苷Rg3由醫院藥劑科提供。

1.2方法

1.2.1細胞培養方法凍存在液氮罐中的細胞取出后復蘇，在15 cm2的培養瓶中培養，待細胞處于對數生長期且鋪滿培養瓶底面70%～80%時進行傳代，分別接種于培養瓶和培養板中。培養瓶中的細胞用于繼續傳代，培養板中的細胞用于加藥處理。

1.2.2細胞處理方法當培養板中的細胞鋪滿50%～60%時，用不含胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的培養基處理細胞24 h，使其生長同步化，隨后分別用不含FBS和藥物培養基處理(對照組)，100、200、400、800 μmol/L 人參皂苷Rg3處理(處理組)。24 h后收集細胞進行噻唑藍(MTT)檢測和Western-blot檢測。

1.2.3MTT法藥物處理24 h后，小心吸去上清，加入160 μL DMEM培養基、40 μL 0.5% MTT溶液，孵箱中繼續培養4 h。隨后吸盡上清，每孔加入200 μL二甲基亞砜，置于搖床上低速振蕩10 min，而后在酶標測儀上檢測490 nm處的吸光值，以對照組的吸光值為100，計算觀察組吸光值的相對值。

1.2.4Western-blot檢測配置RIPA蛋白裂解液，每個細胞孔中加入60 μL，用細胞刮刀充分刮碎細胞并吸出裂解液，離心后去上清進行檢測。檢測時，首先按照配方配置4%的濃縮膠和10%的分離膠，將蛋白樣品加入點樣孔中并進行電泳，垂直電泳方法為100 V、20 min，120 V、90 min，完成后進行電轉膜，方法為100 V、90 min。轉膜后取出硝酸纖維素膜，在5%脫脂牛奶中封閉2 h，而后在1∶1000的細胞周期蛋白E(Cyclin E)、細胞分裂周期蛋白25A(cell division cycle 25A，CDC25A)、actin第一抗體中孵育過夜。第2日，將硝酸纖維素膜置于TBST溶液中洗滌3遍，而后用辣根過氧化物酶標記的第二抗體進行孵育，1 h后再次用TBST洗滌3遍，最后進行顯影。計算蛋白條帶的灰度值，以目的基因的灰度值/內參actin灰度值作為蛋白含量，令空白對照組的蛋白含量作為100，計算處理組目的基因的蛋白含量。

2結果

2.1各組MTT檢測結果及Cyclin E、CDC25A表達量比較對照組、100 μmol/L人參皂苷組、200 μmol/L人參皂苷組、400 μmol/L人參皂苷組、800 μmol/L人參皂苷組各組間MTT值比較差異有統計學意義(P<0.05)； 100 μmol/L人參皂苷組、200 μmol/L人參皂苷組、400 μmol/L人參皂苷組、800 μmol/L 人參皂苷組的MTT值均低于對照組，差異有統計學意義(t=6.886，t=9.966，t=16.623，t=26.223，均P<0.01)。對照組、100 μmol/L人參皂苷組、200 μmol/L人參皂苷組、400 μmol/L人參皂苷組、800 μmol/L人參皂苷組各組間Cyclin E、CDC25A蛋白水平比較差異有統計學意義(均P<0.05)，100 μmol/L人參皂苷組、200 μmol/L人參皂苷組、400 μmol/L人參皂苷組、800 μmol/L人參皂苷組的Cyclin E、CDC25A蛋白水平均低于對照組，差異有統計學意義(t=4.985，t=7.113，t=16.623，t=22.334，均P<0.01；t=5.342，t=8.823，t=17.103，t=24.423，均P<0.01)，見表1。不同濃度人參皂苷Rg3處理后細胞Cyclin E、CDC25A表達量的電泳結果見圖1。

表1各組MTT檢測結果及Cyclin E、CDC25A

表達量比較

組 別MTT值CyclinE蛋白CDC25A蛋白對照組100.0±19.5100.0±18.5100.0±18.5100μmol/L人參皂苷組76.4±16.4a84.3±16.1a79.5±14.8a200μmol/L人參皂苷組56.3±11.5a60.5±12.1a59.1±10.9a400μmol/L人參皂苷組35.2±6.9a39.1±5.2a35.4±6.1a800μmol/L人參皂苷組20.4±4.2a24.5±3.9a22.7±4.2aF17.79215.34517.7293P<0.05<0.05<0.05

MTT：噻唑藍；Cyclin E：細胞周期蛋白E；CDC25A：細胞分裂周期蛋白25A；a與對照組比較，P<0.01

圖1　不同濃度人參皂苷Rg3處理后細胞周期蛋白E(Cyclin E)、細胞分裂周期蛋白25A(CDC25A)表達量的檢測結果　a與對照組比較，P<0.05

2.2細胞增殖能力與Cyclin E、CDC25A蛋白含量的線性回歸分析以MTT值為自變量，Cyclin E、CDC25A蛋白含量為應變量進行線性回歸分析可知，MTT值與Cyclin E、CDC25A蛋白含量呈正相關(P<0.05),見表2。

表2　細胞增殖能力與Cyclin E、CDC25A

Cyclin E:細胞周期蛋白E；CDC25A：細胞分裂周期蛋白25A

3討論

近年來，人參皂苷單體的抗腫瘤作用受到了越來越多的關注，Zhang等[1]的在體研究結果顯示，腹腔注射人參皂苷可以抑制小鼠體內卵巢癌的生長、減小瘤體體積。人參皂苷的活性單體形式包括人參皂苷Rg3、Rh2等，活性單體均能作用于不同的靶點來發揮抗腫瘤作用[2]。人參皂苷Rg3是一種從人參根的浸出液中分離出的四環三萜皂苷[3]。陳云等[2]在乳腺癌MCF-7細胞系中的研究發現，人參皂苷Rg3能使G0/G1期、S期細胞的數目顯著減少，而G2/M期細胞的數目顯著增多，細胞增殖停滯；同時，人參皂苷Rg3還能有效抑制MCF-7細胞株的增殖和侵襲能力。本研究通過MTT方法檢測乳腺癌MCF7Adr細胞株的細胞活力可知，人參皂苷Rg3處理組的MTT值低于對照組，且效應具有劑量依賴性。這一結果也與Ge 等[4]在體內實驗和離體實驗的結果一致，可以反映出人參皂苷Rg3在抑制乳腺癌細胞增殖中的確切價值。

無限的增殖能力以及向周圍組織極強的遷移、侵襲能力是惡性腫瘤細胞最具特征性的生物學行為，這也是導致化療藥物耐受、腫瘤局部復發以及遠處轉移的決定性因素[5]。惡性腫瘤細胞的增殖過程受多種機制的調控，其中CDC25A、Cyclin E是兩種在細胞增殖過程中發揮重要作用的蛋白[6]。CDC25A是雙重特異性磷酸酶家族的成員之一，作用靶點為細胞周期蛋白依賴性激酶，通過催化細胞周期蛋白依賴性激酶發生去磷酸化并促進細胞增殖由G1期進入S期[7]。目前，在結腸癌、乳腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤的研究中均發現CDC25A呈高表達狀態，且與患者的預后情況密切相關[8-9]。Cyclin E是一類細胞周期蛋白，在細胞增殖的G1～S期表達，通過與細胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin dependent kinase 2，CDK2)結合并形成Cyclin E-CDK2復合物，CDK2激活后可調節細胞由G1期向S期過渡。在惡性腫瘤細胞中，Cyclin E過度表達可使CDK2持續激活，并促進腫瘤細胞的不斷增殖[10]。Gao等[11]研究發現，乳腺癌細胞中存在Cyclin E和CDK2的異常表達，表現為Cyclin E的表達與細胞周期不同步。

目前，雖然人參皂苷Rg3的抗腫瘤作用已受到廣泛認可，但關于該藥物具體的分子機制尚未完全闡明，藥物潛在的分子作用靶點仍處于未知狀態。探尋在乳腺癌癌細胞無限增殖過程中的關鍵分子，有助于為尋找更為有效的生物治療靶點。如前所述，CDC25A、Cyclin E是兩種與細胞增殖和細胞周期密切相關的蛋白[12]，通過Western blot的方法檢測乳腺癌細胞中相關蛋白的含量可知，人參皂苷Rg3處理組的CDC25A、Cyclin E蛋白含量均低于對照組，且效應具有劑量依賴性。這就初步反映了人參皂苷Rg3對CDC25A、Cyclin E的調控作用，也可能是人參皂苷Rg3抑制細胞增殖的潛在分子機制。在此基礎上，本研究進行線性回歸分析結果顯示，MTT值與Cyclin E、CDC25A蛋白含量呈正相關，提示下調CDC25A、Cyclin E可能是人參皂苷抑制乳腺癌細胞增殖的分子機制。

綜上所述，人參皂苷Rg3能劑量依賴性地誘導乳腺癌MCF7Adr細胞凋亡，且這一作用是通過抑制Cyclin E、CDC25A的表達來發揮的。

參考文獻

[1]Zhang Q,Kang X,Yang B,etal.Antiangiogenic effect of capecitabine combined with ginsenoside Rg3 on breast cancer in mice[J].Cancer Biother Radiopharm,2008, 23(5):647-653.

[2]陳云，張竝，俞勇，等.人參皂苷Rg3對乳腺癌MCF-7細胞增殖和侵襲的影響[J].中國現代應用藥學，2013，30(7)：722-725.

[3]Chen XP,Qian LL,Jiang H,etal.Ginsenoside Rg3 inhibits CXCR4 expression and related migrations in a breast cancer cell line[J].Int J Clin Oncol,2011, 16(5):519-523.

[4]Ge X,Zhen F,Yang B,etal.Ginsenoside Rg3 enhances radiosensitization of hypoxic oesophageal cancer cell lines through vascular endothelial growth factor and hypoxia inducible factor 1α[J].J Int Med Res,2014,42(3):628-640.

[5]潘曉華，王墨林，崔行，等.人參皂苷Rg3對乳腺癌細胞增殖的影響及其機制探討[J].山東醫藥，2011，51(26)：20-22.

[6]馮曉娜，蔣革，李清，等.人參皂苷Rh2提高人乳腺癌細胞MCF-7對5-氟尿嘧啶誘導凋亡的敏感性[J].沈陽藥科大學學報，2012，29(5)：383-389.

[7]樸麗花，蔡英蘭，張默函，等.人參皂苷Rh2與PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002對乳腺癌細胞轉移和侵襲的影響[J].中國藥房，2013，24(43)：4050-4052.

[8]Park EH,Kim YJ,Yamabe N,etal.Stereospecific anticancer effects of ginsenoside Rg3 epimers isolated from heat-processed American ginseng on human gastric cancer cell[J].J Ginseng Res,2014,38(1):22-27.

[9]Brunetto E,Ferrara AM,Rampoldi F,etal.CDC25A protein stability represents a previously unrecognized target of HER2 signaling in humanbreast cancer:implication for a potential clinical relevance in trastuzumab treatment[J].Neoplasia,2013, 15(6):579-590.

[10]Albert H,Battaglia E,Monteiro C,etal.Genotoxic stress modulates CDC25C phosphatase alternative splicing in human breast cancer cell lines[J].Mol Oncol, 2012,6(5):542-552.

[11]Gao S,Ma JJ,Lu C.Prognostic value of cyclin E expression in breast cancer:a meta-analysis[J].Tumour Biol,2013,34(6):3423-3430.

[12]Duong MT,Akli S,Macalou S,etal.Hbo1 is a cyclin E/CDK2 substrate that enriches breast cancer stem-like cells[J].Cancer Res,2013,73(17):5556-5568.

Effect of Ginsenoside Rg3 on the Induction of MCF7Adr Cells Apoptosis of Breast Cancer and Its Possible Molecular MechanismsZHANGLi.(DepartmentofReagentsandSupply,People′sHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China)

Abstract:ObjectiveTo study the effect of Ginsenoside Rg3 on the induction of MCF7Adr cells apoptosis of breast cancer and its possible molecular mechanisms.MethodsMCF7Adr breast cancer cells were cultured and divided into control group treated with DMEM without FBS and drug,treatment group treated with 100,200,400, 800 μmol/L of ginsenoside Rg3.Cell proliferation was detected by MTT method, protein levels of Cyclin E,cell division cycle (CDC)25A were detected by Western-blot method.ResultsMTT value and protein level of Cyclin E,CDC25A of 100 μmol/L ginsenoside group，200 μmol/L ginsenoside group，400 μmol/L ginsenoside group，800 μmol/L ginsenoside group were lower than those in control group[(76.4±16.4),(56.3±11.5),(35.2±6.9),(20.4±4.2) vs (100.0±19.5)；(84.3±16.1),(60.5±12.1),(39.1±5.2),(24.5±3.9) vs (100.0±18.5)；(79.5±14.8),(59.1±10.9),(35.4±6.1),(22.7±4.2)vs(100.0±18.5)](P<0.01);MTT value was positively correlated content of protein Cyclin E,CDC25A(P<0.05).ConclusionGinsenoside Rg3 can dose dependently induce MCF7Adr cells apoptosis of breast cancer and which is functioned through inhibiting the expression of Cyclin E,CDC25A.

Key words:Breat cancer; Ginsenoside Rg3; Apoptosis; Cyclin E

收稿日期：2014-09-29修回日期：2015-02-27編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.18.047

中圖分類號：R737.9

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)18-3391-03