糖絡(luò)寧對STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)線粒體抗氧化劑活性的影響

張濤靜，龔燕冰，周暉，謝培鳳，關(guān)崧，易文明

?

糖絡(luò)寧對STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)線粒體抗氧化劑活性的影響

張濤靜，龔燕冰，周暉，謝培鳳，關(guān)崧，易文明

目的 觀察中藥復(fù)方糖絡(luò)寧對糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞線粒體中3種抗氧化劑的影響。方法SD雄性大鼠40只，隨機(jī)取7只為對照組，余33只制作鏈脲佐菌素糖尿病大鼠模型，其中29只造模成功后隨機(jī)分為模型組9只、治療組10只、中藥組10只，分別給予生理鹽水、α硫辛酸和糖絡(luò)寧灌胃，共給藥8周，觀察各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞線粒體錳超氧化物歧化酶(MnSOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、過氧化氫酶(CAT)活性的變化。結(jié)果 與對照組比較, 模型組大鼠線粒體MnSOD、GPX、CAT活性(U/mg蛋白)均明顯下降(分別為32.16±4.75vs. 20.17±3.31,45.67±5.64vs. 30.19±4.33,2.87±0.47vs. 1.24±0.34，P<0.01)；與模型組比較，治療組、中藥組大鼠線粒體MnSOD、GPX、CAT的活性均明顯改善(分別為30.78±5.27、39.10±7.67、2.56±0.31和29.14±3.79、39.43±6.23、2.49±0.28，P均<0.01)。結(jié)論 糖絡(luò)寧可顯著提高糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)線粒體中3種抗氧化劑的活性，可能是其防治糖尿病周圍神經(jīng)病變的機(jī)制。

糖絡(luò)寧；糖尿病；線粒體；抗氧化劑；大鼠

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.02.022

糖尿病性周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病最常見慢性并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者致殘的主要原因，嚴(yán)重影響了糖尿病患者的生存質(zhì)量，其發(fā)病率與病程有關(guān)[1，2]。目前研究證實(shí)氧化應(yīng)激是DPN最核心和關(guān)鍵的發(fā)病機(jī)制，其中線粒體氧化應(yīng)激在DPN發(fā)病中顯得尤為重要。而引起線粒體氧化應(yīng)激的一個重要因素是線粒體中抗氧化劑錳超氧化物歧化酶(MnSOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、過氧化氫酶(CAT)等活性大幅度下降。中藥復(fù)方制劑糖絡(luò)寧治療DPN有較好療效，但具體作用機(jī)制不明，本實(shí)驗(yàn)復(fù)制DPN大鼠模型，觀察糖絡(luò)寧對鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)DPN大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞線粒體抗氧化劑活性的影響，從而探討其治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：清潔級雄性8周齡SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，合格證號：SCXK(京)2012-0001，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司供給。實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周。實(shí)驗(yàn)室條件：GB14925-2001規(guī)定動物實(shí)驗(yàn)設(shè)施大鼠清潔級屏障環(huán)境[環(huán)境安全合格證號：SYXK(京)2011-0024],室內(nèi)相對溫度(25±1)℃,相對濕度(60±10)%。(2)試劑：STZ(美國Merck公司，批號B69776)，以下試劑盒由南京建成生物工程研究所提供：CAT、MnSOD、GPX原位檢測試劑盒。α硫辛酸(a-lipoic acid)(批號82159-09-9)。氯化鉀、甘露醇、蔗糖、EDTA、TRIS-HCl、磷酸氫二鉀、琥珀酸、疊氮鈉、吡啶等均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司生產(chǎn)分析純。(3)儀器：YQ-3型電動勻漿機(jī)(無錫沃信儀器有限公司)；5417R型臺式高速低溫離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；CP224C精密電子天平(美國奧豪斯公司)；UV754N型紫外可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；RF-5301PC熒光分光光度計(日本日本島津公司)；XK95-B型漩渦混合器(江蘇姜堰市康泰醫(yī)療器材廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模及分組： SD雄性大鼠40只，造模前隨機(jī)選擇7只為對照組，其余大鼠予STZ 60 mg/kg腹腔注射，72 h后測血糖≥16.7 mmol/L為造模成功，將成模大鼠29只隨機(jī)分為治療組10只、中藥組10只、模型組9只。

1.2.2 給藥方法： 中藥組給予糖絡(luò)寧制劑(為東方醫(yī)院制劑室自制，約為生藥10 g/ml，方藥組成：丹參、全蝎、生黃芪、牛膝、狗脊等)按生藥5 g·kg-1·d-1灌胃，換算成糖絡(luò)寧為0.5 ml灌胃；治療組按20 mg/kg·d灌胃，使用時將α硫辛酸用蒸餾水配成混懸液(2.5 mg/ml)灌胃；模型組及對照組予等量生理鹽水灌胃，實(shí)驗(yàn)期間自由飲食，連續(xù)給藥8周。

2 結(jié) 果

與對照組比較, 模型組大鼠線粒體MnSOD、GPX、CAT活性均明顯下降(q值28.31、29.14、26.13P<0.01)；與模型組比較，治療組、中藥組大鼠線粒體MnSOD、GPX、CAT活性均明顯改善(q值分別為27.16、28.16、25.24和26.78、28.34、24.87，P均<0.01)；治療組與中藥組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠8周后背根神經(jīng)節(jié)線粒體MnSOD、GPX及CAT活性比較蛋白)

注：與對照組比較，aP<0.01；與模型組比較,bP<0.01

3 討 論

STZ造模形成的DPN大鼠模型，其實(shí)是1型糖尿病大鼠模型，但經(jīng)過我們多年的實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)此種造模方式，造模成功率高，動物病死率低，神經(jīng)損害較為嚴(yán)重，是比較適合的DPN大鼠模型。

DPN是糖尿病最為常見的慢性并發(fā)癥,常表現(xiàn)為對稱性遠(yuǎn)端多神經(jīng)病變,以下肢對稱性麻木發(fā)涼為主要表現(xiàn)，是導(dǎo)致糖尿病患者生活質(zhì)量下降甚至致殘的原因之一。DPN的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，近年來的證據(jù)表明氧化應(yīng)激(oxidativestress)，尤其是線粒體氧化應(yīng)激在DPN的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。線粒體(mitochondria)作為神經(jīng)細(xì)胞中最主要的產(chǎn)能及氧化細(xì)胞器，其內(nèi)存在多種抗氧化劑，其中以MnSOD、GPX、CAT三者最為重要。正常情況下三大抗氧化劑的存在能保障活性氧簇(ROS)處于一個正常水平，其中MnSOD可還原O2-為H2O2，GPX、過氧化氫酶可將H2O2還原為H2O，高血糖下不僅上述抗氧化劑水平下降，其表達(dá)也受到抑制[7，8]，引起線粒體內(nèi)抗氧化水平下降，ROS大量產(chǎn)生。 我們的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)線粒體中所有抗氧化劑的活性較對照組均顯著下降，提示神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)線粒體中抗氧化劑活性下降與DPN的發(fā)生密切相關(guān)。而使用抗氧化劑α硫辛酸后線粒體中各抗氧化劑的活性都得到一定程度恢復(fù)，這可能是α硫辛酸治療DPN、抗氧化作用的機(jī)制之一。DPN中醫(yī)病名為“消渴病痹痿”，我們認(rèn)為其基本病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛為肝腎不足，標(biāo)實(shí)為瘀血阻絡(luò)，治法為滋補(bǔ)肝腎、活血通絡(luò)，糖絡(luò)寧方中牛膝、狗脊滋補(bǔ)肝腎，丹參、全蝎活血通絡(luò)，共同發(fā)揮作用。糖絡(luò)寧的臨床療效已得到多項(xiàng)研究證實(shí)[9～12]，機(jī)制研究也證實(shí)糖絡(luò)寧可降低糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)山梨醇水平[13]，升高糖尿病大鼠血清神經(jīng)生長因子(NGF)含量和坐骨神經(jīng)NGFmRNA表達(dá)[14]，升高血清中IGF-I的含量，上調(diào)糖尿病大鼠肝組織IGF-ImRNA表達(dá)[15]。后續(xù)的一些研究還證實(shí)糖絡(luò)寧可提高糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)中線粒體呼吸鏈各個復(fù)合物的活性[4]，不過這只是間接減少線粒體氧化應(yīng)激。本研究則檢測與線粒體氧化應(yīng)激直接相關(guān)的抗氧化劑活性，并證實(shí)糖絡(luò)寧可顯著改善糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)線粒體抗氧化劑的活性，從而直接提供了糖絡(luò)寧減少線粒體氧化應(yīng)激的證據(jù)，這可能是其防治DPN的機(jī)制之一。

1 《中國糖尿病防治指南》編寫組.中國糖尿病防治指南[M].北京:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社,2004:40.

2AmericanDiabetesAssociation.Standardsofmedicalcareindiabetes--2014[J].DiabetesCare,2014,37(Suppl1):S14-S80.

3 張秀麗,于德紅,劉德勝,等.梓醇對魚藤酮致小鼠中腦和紋狀體線粒體酶活性改變的改善作用[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2012,26(5):618-623.

4 張濤靜,龔燕冰,周暉,等.糖絡(luò)寧對STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)線粒體呼吸鏈復(fù)合物的影響[J].北京中醫(yī)藥,2013,32(8):621-624.

5 徐志剛,吳晨光,王麗,等.α-硫辛酸對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響[J].江蘇大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2011,21(1):15-17, 封2.

6 吳慶秋,何蘭杰.枸杞多糖對2型糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變的保護(hù)作用[J].中國糖尿病雜志,2013,21(7):647-650.

7VincentAM,RussellJW,SullivanKA,etal.SOD2protectsneuronsfrominjuryincellcultureandanimalmodelsofdiabeticneuropathy[J].ExpNeurol,2007,208(2):216-227.

8BuggerH,BoudinaS,HuXX,etal.Type1diabeticakitamouseheartsareinsulinsensitivebutmanifeststructurallyabnormalmitochondriathatremaincoupleddespiteincreaseduncouplingprotein3[J].Diabetes,2008,57(11):2924-2932.

9 高彥彬,周暉,張濤靜,等.糖絡(luò)寧治療糖尿病周圍神經(jīng)病變臨床研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2013,28(6):1673-1677.

10 張濤靜,高彥彬,謝培鳳,等.糖絡(luò)寧配合中藥泡洗治療糖尿病性周圍神經(jīng)病變的臨床研究[J].疑難病雜志,2011,10(4):263-265.

11 張濤靜，高彥彬，趙迪，等.糖絡(luò)寧配合穴位按摩治療糖尿病性周圍神經(jīng)病變的臨床研究[J].疑難病雜志，2007，6(7):398-401.

12 林洪彬，李作武.脈絡(luò)寧口服液治療2型糖尿病合并視網(wǎng)膜病變的臨床研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，7(17)：35-36.

13 張濤靜,高彥彬,周暉,等.中藥復(fù)方對STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)山梨醇含量的影響[J].北京中醫(yī)藥,2011,30(5):394-396.

14 張濤靜,高彥彬,周暉,等.糖絡(luò)寧對STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠血清NGF含量及坐骨神經(jīng)NGFmRNA表達(dá)的影響[J].江蘇中醫(yī)藥,2011,43(2):81-83.

15 高彥彬,張濤靜,周暉,等.糖絡(luò)寧對STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠血清IGF-1含量及肝組織IGF-1基因表達(dá)的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2009,32(7):454-456, 461.

Effect of Tangluoning on activities of mitochondrial antioxidants in dorsal root ganglion in STZ induced diabetic rats

ZHANGTaojing,GONGYanbin,ZHOUHui,XIEPeifeng,GUANSong,YIWenming.

DepartmentofEndocrinology,DongfangHospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100078,China

Objective To observe the effect of Chinese herbal compoundTangluoningon3kindsofantioxidantsmitochondrialdorsalrootganglioncellsindiabeticrats.Methods There were 40 SD male rats, 7 of them were randomly selected as the control group, the rest 33 were used to establish the streptozotocin (STZ) diabetic rat model, 29 rats of the model were randomly divided into model group with 9 rats, treatment group with 10 rats, Chinese medicine group with 10 rats, they were given saline, alpha lipoic acid andTangluoningrespectively,theywasgiventhemedicinefor8weeks,mitochondriaofratmanganesesuperoxidedismutase(MnSOD),glutathioneperoxidase(GPX),catalase(CAT)activitychangesofthedorsalrootganglioncellswereobserved.Results Compared with the control group, the model group rats’ mitochondrial MnSOD, GPX, the activity of CAT (U/mg protein) decreased significantly (32.16±4.75 vs. 20.17±3.31, 45.67±5.64 vs. 30.19±4.33, 2.87±0.47 vs. 1.24±0.34,P<0.01);comparedwiththemodelgroup,treatmentgroupandthetraditionalhinesemedicinegroup’smitochondrialMnSOD,GPX,theactivityofCATweresignificantlyimproved(30.78±5.27, 39.10±7.67, 2.56±0.31, 29.14±3.79, 39.43±6.23, 2.49±0.28,respectively,P<0.01). Conclusion It proved that theTangluoningwouldsignificantlyimprovethe3kindsofantioxidantactivityindorsalrootganglionmitochondriaofdiabeticrats,whichmaybethemechanismofTangluoningforpreventionandtreatmentofdiabeticperipheralneuropathy.

Tangluoning;Diabetesmellitus;Mitochondria;Antioxidant；Rats

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(No.81102574)；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.81473663)；北京中醫(yī)藥大學(xué) 臨床自主創(chuàng)新課題(No.2011JYBZZJSY-087)

100078 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院內(nèi)分泌科

2014-11-04)