CCR2和CCR5基因多態性與結核性膿胸的關系

徐偉樂，李輝，秦學博，侯宏偉，齊海亮

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CCR2和CCR5基因多態性與結核性膿胸的關系

徐偉樂，李輝，秦學博，侯宏偉，齊海亮

目的 探討CCR2基因-190 G/A和CCR5基因-59029 G/A單核苷酸多態性(SNP)與結核性膿胸的關系。方法 采用聚合酶鏈反應—限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)方法對結核性膿胸患者300例和健康對照組300例進行CCR2基因-190 G/A和CCR5基因-59029 G/A SNPs檢測。結果 與CCR2基因-190 GG基因型相比，攜帶AG和AA基因型均可增加結核性膿胸發病風險(OR=2.254，95%CI 1.043～4.868；OR=8.728，95%CI 4.224～18.033)。進行分層分析發現，無卡介苗(BCG)接種史、體質量指數(BMI)<18.5 kg/m2均增加結核性膿胸發病風險(OR=3.309，95%CI 2.108～4.382；OR=2.767，95%CI 1.918～3.993)。CCR5基因-59029 G/A 各基因型未入選回歸方程，無統計學意義(P>0.05)。結論CCR2基因-190G/ASNP可能與結核性膿胸的發病風險有關；CCR5基因-59029G/ASNP可能與結核性膿胸無關。

結核性膿胸；CCR2基因；CCR5基因；單核苷酸多態性

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.02.009

結核性膿胸為胸膜腔結核桿菌嚴重感染，并產生膿性滲出液積聚所致，發病率近年來呈明顯上升趨勢。結核桿菌侵犯胸膜組織的過程，是由多種細胞因子參與的細胞免疫過程。CCR2和CCR5作為重要的CC趨化因子受體，具有調控T細胞和單核細胞/巨噬細胞系遷移、增殖與免疫的功能，在炎性反應部位募集和活化免疫細胞中扮演了重要角色。現采用PCR-RFLP方法對結核性膿胸患者進行CCR2基因-190 G/A和CCR5基因-59029 G/A 單核苷酸多態性(SNPs)的研究，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2011年1月—2014年1月于河北省胸科醫院微創外科行手術治療結核性膿胸患者300例，術后標本均經病理學證實，同時排除HIV感染者、糖尿病、高血壓、冠心病及有家族遺傳史患者。病程9～12個月，中位數10個月。其中男165例，女135例，年齡23～60歲，中位年齡41.5歲。同期在河北省胸科醫院體檢中心健康體檢者300例為健康對照組，其中男159例，女141例，年齡28～59歲，中位年齡43.5歲。2組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。2組對象性別、年齡、卡介苗(BCG)接種史、體質量指數(BMI)狀況在經當事人知情同意前提下由專門的登記員詢問調查。

1.2 觀測方法

1.2.1DNA提取： 采集每位對象靜脈血5ml，經枸櫞酸鈉抗凝，置4℃冰箱保存，并于采血后1周內提取外周血白細胞DNA。采用蛋白酶K消化—飽和氯化鈉鹽析法。具體操作程序如下：外周血5ml加冷蒸餾水至50ml，2 500r/min室溫離心10min，棄上清。重復2～3次至紅細胞完全裂解。加入預冷的0.1%Triton-X100 45ml同上離心去上清，洗滌1～2次。沉淀加3mlDNA提取液，充分混勻，懸浮白細胞，加10%SDS150μl(終濃度0.5%)劇烈振蕩至無凝塊。加入蛋白酶K至終濃度為100μg/ml(1mg/ml約400μl)，混勻，37℃消化過夜。然后，加入5mol/L的NaCl1.2ml，劇烈振蕩15s，2 500r/min室溫離心15min。將上清倒入另一離心管中，棄沉淀。上清中加入100%乙醇8ml，反復顛倒混勻，置DNA至高壓滅菌的Eppendorf管中，以70%乙醇洗滌1～2次，倒置Eppendorf管并使乙醇揮發干凈。以200μlTE溶解DNA，4℃至少放置24h，徹底溶解后經電泳或測OD值定量。

1.2.2PCR擴增：CCR2基因-190G/A和CCR5基因-59029G/A引物均參考文獻[1，2]設計，由上海伯昊生化科技有限公司合成。-190G/A上游引物序列：5'-CATTGCAATCCCAAAGACCCACTC-3'，下游引物序列：5'-TTGGTTTTGTGGGCAACATGATGG-3'。-59029G/A上游引物序列：5'-CCCGTGAGCCCATAGTTAAAACTC-3'，下游引物序列：5'-TCACAGGGCTTTTCAACAGTAAGG-3'。反應條件：預變性94℃ 5min、94℃變性30s、退火溫度(-190G/A為56℃、-59029G/A為62℃) 30s、72℃ 延伸30s35個循環后，最后72℃延伸 5min。1.2.3 擴增產物的限制性酶切： 分別應用BsaBI酶對-190G/A擴增產物，Bspl2861酶對-59029G/A擴增產物進行酶切，分別取酶切產物在3%(-190G/A)和2%(-59029G/A)瓊脂糖凝膠上進行電泳，以100bpMarker為參照，紫外燈下觀察、拍照并分析其結果。

1.3 統計學方法 采用SPSS19.0版軟件對數據進行統計分析處理。比較各位點基因型頻率的觀察值與預期值并進行卡方檢驗及Hardy-Weinberg平衡分析。以二元Logistic回歸法計算相對風險度的比值比(oddsratio,OR)及95%可信區間(confidenceinterval,CI)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 基因型分析 (1)健康對照組-190G/A和-59029G/A位點的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，表明樣本來自于同一人群，具有群體代表性。(2)結核性膿胸患者CCR2基因-190G/A位點的PCR擴增片段長度為173bp，酶切產物進行電泳，AA基因型僅見1條173bp電泳帶，AG基因型顯示為173bp、149bp和24bp(24bp不顯示) 3條帶，GG基因型表現為149bp和24bp(24bp不顯示) 2條帶(圖1)。CCR5基因-59029G/A位點的PCR擴增片段長度為268bp，酶切產物進行電泳，AA基因型僅見1條268bp電泳帶，AG基因型可見3條帶分別為268bp、137bp和131bp，GG基因型表現為137bp和131bp2條帶(圖2)。

注：M.Marker；1,3,7.AA；4,6,11.AG；2,5,8,9,10.GG

注：M.Marker；1,2,4.AA；3,6.AG；5,7.GG

2.2Logistic回歸分析 將BCG接種史、BMI、CCR2基因-190G/A各基因型和CCR5基因-59029G/A各基因型作為自變量，結核性膿胸組和健康對照組作為因變量代入二分類Logistic回歸方程，計算OR值和95%可信區間。分析發現，對于-190G/A位點，與GG基因型相比，攜帶AG和AA基因型均可明顯增加結核性膿胸發病風險(OR=2.254, 95%CI1.043～4.868和OR=8.728, 95%CI4.224～18.033)。進一步分層分析發現，無BCG接種史、BMI<18.5kg/m2均可增加結核性膿胸發病風險(OR=3.309, 95%CI2.108～4.382和OR=2.767, 95%CI1.918～3.993)，見表1。對于-59029G/A位點，各基因型未選入回歸方程，無統計學意義(P>0.05)，表明-59029G/ASNP與結核性膿胸的發病風險無明顯相關性。見表2。

表1 回歸方程中的變量

表2 不在回歸方程中的變量

3 討 論

CCR2是單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的特異受體，編碼355個氨基酸殘基蛋白，在各種細胞類型上都有發現。MCP-1與CCR2結合后可趨化多種炎性細胞，除單核/巨噬細胞外，還包括記憶和殺傷T淋巴細胞、NK細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、樹突狀細胞等至炎性病灶而發揮免疫作用。CCR2基因存在多個研究SNP位點，其中位于啟動子區的-190G/ASNP可引起不同程度的轉錄活性改變，從而影響其蛋白表達水平及功能,進一步影響個體間對疾病遺傳易感性的差異。Sezgin等[1]發現-190G/A位點各基因型在慢性腎衰竭患者和正常人群中分布有顯著性差異，增加慢性腎衰竭發病風險。Miyagishi等[3]發現在日本人群中-190位點G→A突變與多發性硬化的發生呈負相關。關于此位點與結核病關系的研究，國內外已有報道，結論不盡一致，韓銳等[4]采用病例對照研究，應用MassARRAY技術對-190G/A位點進行基因研究，發現CCR2基因-190G/ASNP與中國漢族兒童結核病易感不存在相關性。而在對印度中北部Sahariya部落人群的研究中顯示[5]，對照組的AA基因型和A等位基因的頻率明顯高于結核病組，AA基因型對于結核病具有保護作用。本研究通過對中國河北地區結核性膿胸患者與健康對照組的病例—對照研究發現，CCR2基因-190G/ASNP與結核性膿胸發病風險相關，即攜帶A等位基因會增加結核性膿胸的發病風險，進一步通過分層分析發現，無卡介苗接種史、BMI<18.5kg/m2增加人群患結核性膿胸的風險。造成各研究結果的差異可能原因如下：(1)CCR2基因-190G/ASNP本身是一種功能性還是無意義性突變仍未成定論；(2)樣本量的大小不同；(3)不同人群、種族基因型分布頻率的多樣性。

總之，結核性膿胸的發病是一個多因素參與的錯綜復雜的過程，其中易感基因多態性影響人類對結核性膿胸易感性。限于樣本量、遺傳背景差異等因素，報道結果存在差異。因此，大樣本量、不同種族人群的進一步研究對闡明SNP在結核性膿胸發生機制中的作用具有重要的意義。

1SezginI,KoksalB,BagciG,etal.CCR2polymorphisminchronicrenalfailurepatientsrequiringlong-termhemodialysis[J].InternalMedicine,2011,50(21):2457-2461.

2 王睿,張松,時立新.CCR5基因啟動子多態性與2型糖尿病腎病相關性研究[J].貴州醫藥,2007,31(6):500-503.

3MiyagishiR,NiinoM,FukazawaT,etal.C-Cchemokinereceptor2genepolymorphisminJapanesepatientswithmultiplesclerosis[J].Neuroimmunol,2003,145(1/2):135-138.

4 韓銳,綦輝,孫琳,等.CCR2、CCL5、CCR5和CCL1基因多態性與中國漢族兒童結核病易感性的關聯研究[J].標記免疫分析與臨床,2014,21(2):171-175.

5MishraG,PoojarySS,RajP,etal.GeneticpolymorphismsofCCL2,CCL5,CCR2andCCR5genesinSahariyatribeofNorthCentralIndia:anassociationstudywithpulmonarytuberculosis[J].InfectGenetEvol,2012,12(5):1120-1127.

6 盛磊,常生軍,程江.CCR5基因多態性的研究進展[J].實用醫技雜志,2007,14(4):429-430.

7 程潔.MCP-1、RANTES及CCR5基因多態性與2型糖尿病腎病[D].長沙：中南大學，2006.

8NakajimaK,TanakaY,NomiyamaT,etal.ChemokinereceptorgenotypeisassociatedwithdiabeticnephropathyinJapanesewithtype2diabetes[J].Diabetes,2002,51(1):238-242.

9SmithMW,DeanM,CartingT,etal.ComtrastinggeneticinfluenceofCCR2andCCR5variantsonHIV-1infectionanddiseaseprogression[J].Science,1997,277(5328):959-965.

10MamtaniM,MummidiS,RamsuranV,etal.InfluenceofvariationsinCCL3LlandCCR5ontuberculosisinanorthwesternColombianpopulation[J].JInfectDis,2011,203(11):1590-1594.

Association of CCR2 gene and CCR5 gene polymorphisms with the risk of tuberculous empyema

XUWeile,LIHui,QINXuebo,HOUHongwei,QIHailiang.

DepartmentofMinimallyInvasiveSurgery,HebeiThoracicHospital,Shijiazhuang050041,ChinaCorrespondingauthor:QIHailiang,E-mail:kk20140612@126.com

Objective To investigate the relationship of CCR2 gene-190 G/A, CCR5 gene-59029 G/A single nucleotide polymorphism (SNP) and tuberculous empyema.Methods Using polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method, 300 cases of tuberculous empyema patients and 300 healthy control were received 190 G/A and 59029 G/A SNPs detection.Results Compared to CCR2 gene-190 GG genotype, carrying AG and AA genotype can increase the risk of tuberculous empyema (OR=2.254, 95%CI 1.043-4.868; OR=8.728, 95%CI 4.224-18.033). Stratified analysis revealed that, without Bacillus Calmette Guerin (BCG) vaccination history, body mass index (BMI) <18.5 kg/m2were all increased the risk of tuberculous empyema (OR=3.309, 95%CI 2.108-4.382; OR=2.767, 95%CI 1.918-3.993). CCR5 gene-59029 G/A genotypes were not selected in the regression equation, no statistical significance was found (P>0.05). Conclusion CCR2 gene-190 G/A SNP might be related to the tuberculous empyema. CCR5 gene-59029 G/A SNP may have no association with tuberculous empyema.

Tuberculous empyema; CCR2 gene; CCR5 gene; Single nucleotide polymorphism

050041 石家莊，河北省胸科醫院微創外科

齊海亮，E-mail:kk20140612@126.com

2014-11-08)