內皮型一氧化氮合酶在2型糖尿病大鼠主動脈的表達及羅格列酮干預效果

胡麗葉，陳紅軍，宋光耀，朱旅云

糖尿病患病率逐年上升，2007—2008年全國20～80歲城市人群患病率男性為12.8%，女性為10.1%［1］。糖尿病的主要危害是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)，而在出現AS臨床表現前，已經存在血管內皮細胞功能障礙［2］，表現為內皮素、一氧化氮等分泌異常。內皮型一氧化氮合酶(endothelia nitric oxide synthase，eNOS)是一氧化氮合成的關鍵酶，在維持血管正常功能中起重要作用［3-4］，是重要的抗AS因子。噻唑烷二酮類藥物(thiazolidinediones，TZDs)可改善與胰島素抵抗(insulin resistance，IR)相關的代謝紊亂［5］，具有血管保護作用。本研究通過動物實驗對2型糖尿病(T2DM)早期血管病變進行觀察，觀察血清葡萄糖、內皮素、一氧化氮變化，主動脈光鏡下病理學變化，eNOS蛋白及其mRNA表達，并應用TZDs進行干預研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 7周齡雄性Wistar大鼠80只(購自河北醫科大學實驗動物中心，合格證號:912111)，體重128～140 g，適應性飼養1周后體重171～200 g。隨機分為對照組、高脂組、模型組和治療組，每組20只。

1.2 方法

1.2.1 模型制備:對照組以普通飼料喂養，高脂組、模型組及治療組以高脂飼料(普通飼料87.5%，精煉豬油10%，膽固醇2.0%，膽酸鹽0.3%，丙硫氧嘧啶0.2%，蔗糖10%)飼養，4周后，模型組和治療組腹腔注射25～30 mg/kg鏈脲佐菌素(溶于無菌枸櫞酸緩沖液，pH 4.4，現用現配)，對照組及高脂組腹腔注射等量0.1 mol/L檸檬酸溶液。造模前各組動物狀態好，反應靈敏，被毛光澤。模型組及治療組大鼠成模后攝食偏少，飲水量及尿量多，體重偏輕，2周后空腹血糖≥7.8 mmol/L為造模成功［6］。

1.2.2 給藥方法:對照組繼續應用普通飼料喂養，高脂組、模型組、治療組繼續以高脂飼料喂養，且治療組給予羅格列酮4 mg/(kg·d)溶于2 ml蒸餾水灌胃，模型組以等量蒸餾水灌胃。試驗過程中模型組死亡1只。

1.2.3 標本采集:各組分別于給藥后6、12周，禁食過夜8～12 h，應用10%水合氯醛3～4 ml/kg對大鼠進行麻醉，從大鼠胸部中線切開，暴露主動脈，以5 ml注射器從主動脈取血檢測生化指標，取主動脈弓下段2～3 cm組織行病理學觀察，取其中6只的主動脈組織檢測eNOS蛋白及其mRNA表達情況。

1.3 檢測方法

1.3.1 血糖、內皮素和一氧化氮檢測:應用全自動生化分析儀進行血糖的測定，采用葡萄糖氧化酶法;內皮素的檢測采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA);一氧化氮的檢測采用硝酸還原酶法。

1.3.2 病理學觀察:所取組織于10%中性甲醛溶液中固定48 h后，脫水、石蠟包埋，以2.5μm厚度切片，做常規HE染色，在光鏡下觀察主動脈病理變化。

1.3.3 組織總蛋白提取與蛋白免疫印跡(Western blot)分析:提取蛋白，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉膜，5%脫脂奶粉封閉，置入1∶300稀釋的一抗溶液中，4℃緩慢搖動過夜。洗滌后置入以 TTBS 1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗溶液中，于室溫反應2 h。之后用TTBS室溫洗膜3次。抗體結合區帶用化學發光法檢測。

1.3.4 實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應(RTPCR)檢測mRNA表達:按TRIZOL試劑說明書提取細胞總RNA，測定RNA濃度及純度，取RNA溶液4μl，按PCR試劑盒說明進行逆轉錄和PCR擴增。擴增完畢后，進入結果分析界面，以GAPDH為內參照基因，與對照組相比，得到目的基因表達的相對定量值(RQ值)，將RQ值用于統計分析。GAPDH擴增片段長度 120 bp，上游引物:5＇-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3＇，下游引物:5＇-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3＇;eNOS 擴增片段長度 72 bp，上游引物:5＇-GGCAAGACCGATTACACGAC-3＇，下游引物:5＇-GGCAGCCAAACACCAAAGT-3＇。反應條件:42℃反轉錄 50 min，95℃ 5 min滅活反轉錄酶。96℃ 4 min，然后三步反應:94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，進行40個循環，于每個循環的第三步(72℃ 30 s)收集熒光信號。

1.4 統計學方法 應用SPSS 10.0統計軟件處理，計量資料用均數±標準差(x±s)表示，先進行方差齊性檢驗，再采用單因素方差分析，以LSD法進行組間比較，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 生化指標 給藥6和12周，模型組和治療組血糖均較對照組和高脂組升高，且治療組低于模型組(P＜0.05，P＜0.01);除給藥12周治療組甘油三酯外，高脂組、模型組和治療組膽固醇、甘油三酯及內皮素均較對照組升高，一氧化氮較對照組降低(P＜0.05，P ＜0.01);給藥6、12周甘油三酯治療組低于模型組，模型組高于高脂組，給藥12周治療組膽固醇均較模型組下降(P＜0.05，P＜0.01)。給藥12周時模型組內皮素高于高脂組，一氧化氮低于高脂組，治療組內皮素低于模型組，一氧化氮高于模型組(P＜0.05，P＜0.01);模型組給藥12周時一氧化氮較給藥6周時下降(P＜0.05)。各組間其他指標比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 4組大鼠血糖、血脂、內皮素和一氧化氮變化(x±s)

2.2 主動脈病理形態改變 給藥6周時對4組大鼠主動脈進行HE染色光鏡下可見，內皮細胞連續，平滑肌及彈力纖維排列規則，未見淋巴細胞浸潤等病理改變;12周時光鏡下可見，對照組動脈壁光滑，內皮細胞、平滑肌細胞排列規則，彈力纖維排列整齊，未見浸潤的淋巴細胞等病理改變;高脂組主動脈內皮不連續，但彈力纖維及平滑肌細胞排列尚整齊，未見浸潤的淋巴細胞等病理改變;模型組主動脈內皮細胞不連續，平滑肌細胞和彈力纖維排列紊亂，內膜增厚，內皮下間隙增寬，內皮細胞表面可見浸潤的淋巴細胞;治療組內皮細胞不連續，平滑肌細胞排列紊亂，并可見淋巴細胞浸潤，但程度較模型組減輕。見圖1。

2.3 主動脈eNOS蛋白及其mRNA表達 糖尿病成模后給藥6、12周時，eNOS蛋白表達高脂組、模型組和治療組較對照組下調，模型組較高脂組下調，治療組較模型組上調(P＜0.01)，治療組較高脂組eNOS蛋白表達下調，但差異無統計學意義(P＞0.05);給藥6、12周時，主動脈eNOS的mRNA表達高脂組、模型組和治療組較對照組下調，模型組和治療組較高脂組下調(P＜0.05，P＜0.01)，治療組與模型組比較差異無統計學意義(P＞0.05);4組給藥后12周eNOS蛋白及其mRNA表達與給藥6周比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2，圖2。

圖1 4組大鼠給藥12周主動脈光鏡下所見(HE×100)A.對照組;B.高脂組;C.模型組;D.治療組

3 討論

與非糖尿病人群相比，糖尿病人群中AS的患病率高，發病年齡早，且病情進展較快、病情較重、病死率高。70%～80%糖尿病患者死于大血管病變，高血糖與高血脂等因素是導致AS發生的原因［7-8］，早期表現為血管內皮功能紊亂，其中一氧化氮和內皮素是由內皮細胞分泌的具有拮抗作用的血管活性物質，對于維持血管正常舒縮功能具有重要意義［9］。一氧化氮是內皮細胞分泌最強的血管舒張因子，一氧化氮合酶(nitric oxidesynthase，NOS)是其合成的限速酶，靜止期的內皮細胞主要表達eNOS，催化生成低濃度的一氧化氮，用以舒張血管和抑制血小板聚集。當受到外來損傷如高糖刺激時，誘導型eNOS被激活，誘導高濃度的一氧化氮合成，引起內皮細胞損傷和凋亡［10］。Samaha 等［11］研究證明，TZDs能通過增加介導膽固醇外流的載體ABCG1的表達，增加巨噬細胞內膽固醇的外流，抑制泡沫細胞形成。本研究結果顯示，模型組和高脂組的縮血管物質內皮素均升高，以及舒血管物質一氧化氮下降，且模型組在12周時內皮素升高和一氧化氮下降更顯著。提示高血糖、高血脂可促進AS，兩者并存時的促進AS作用更明顯。而羅格列酮可降低內皮素水平，促進一氧化氮分泌，改善一氧化氮/內皮素失衡，發揮其抗AS作用。

表2 4組大鼠內皮型一氧化氮合酶蛋白及其mRNA在主動脈的表達(x±s)

圖2 4組大鼠主動脈內皮型一氧化氮合酶蛋白表達A.給藥后6周;B.給藥后12周

有報道，制備糖尿病大鼠模型后高糖高脂喂養8周，鏡下可觀察到糖尿病動脈硬化的早期表現，如纖維組織增生、核細胞增多等［12］。羅格列酮治療后內皮細胞和平滑肌細胞排列較規整，中膜細胞數減少，提示羅格列酮不僅可改善血管內皮細胞功能，還可阻止主動脈結構重塑［13］。本研究糖尿病成模后給藥6周時4組均未發現早期AS病理表現，但在12周時高脂組、模型組及治療組均發現早期AS病理改變，而治療組則較模型組有所減輕。提示羅格列酮可以使T2DM大鼠AS減輕，分析其原因可能與其通過降低血糖、血脂、改善IR及抗炎作用而改善T2DM大鼠內皮依賴性血管舒張功能有關。

內皮功能障礙是AS始動環節，其致不正常的血管收縮、血小板黏附聚集、白細胞黏附、內皮通透性增加及細胞因子的產生，低密度脂蛋白膽固醇轉移至內膜，形成炎性反應、血栓、平滑肌細胞異常增殖、遷移，促進AS形成和惡化。一氧化氮是血管內皮細胞分泌的具有舒血管作用的活性物質，對維持基礎狀態下血管張力具有重要作用。大量研究顯示，高脂血癥動物和患者均伴有血管內皮功能不全［14-15］。研究表明糖尿病時血管內皮細胞活性氧類物質生成增多，引起eNOS表達下調及一氧化氮的生物利用度降低，進而導致糖尿病血管內皮功能障礙［16］。通過適當治療內皮功能障礙是可能逆轉的，且提高一氧化氮濃度可改善血管內皮功能［17］。

本研究顯示T2DM成模后給藥6周時即可觀察到高脂組、模型組和治療組主動脈eNOS蛋白表達下降，提示高血脂、高血糖可促使主動脈eNOS表達下降，導致內皮功能紊亂。同時，本研究還顯示治療組主動脈eNOS蛋白表達較模型組上調，說明噻唑烷二酮類藥物可在一定程度改善內皮功能。

綜上所述，高血糖、高血脂可導致內皮素升高和一氧化氮下降，以及eNOS蛋白及其mRNA表達異常，從而引起AS，噻唑烷二酮類藥物對血管內皮功能、病理形態和eNOS蛋白及其mRNA表達異常有一定逆轉作用。

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