不同儲(chǔ)存時(shí)間血液制備洗滌紅細(xì)胞效果分析

李美霖 段錦 麻靜敏 車進(jìn) 張燕華 李天君

洗滌紅細(xì)胞經(jīng)0.9%氯化鈉溶液洗滌，去除了其中大部分血漿、白細(xì)胞和血小板［1］，可減少非溶血性發(fā)熱反應(yīng)(NHFTR)和血漿蛋白所致的過(guò)敏反應(yīng)，減少或降低輸血傳播病毒的概率。雖然洗滌紅細(xì)胞只能保留70%～80%的原紅細(xì)胞，保存期較短，但臨床貧血患者和緊急輸血時(shí)均首選洗滌紅細(xì)胞［2，3］，所以臨床需求呈上升趨勢(shì)。2012年7月衛(wèi)生部發(fā)布的《全血及成分血質(zhì)量要求》(GB18469-2012)［4］將洗滌紅細(xì)胞質(zhì)量控制項(xiàng)目中的“紅細(xì)胞回收率”調(diào)整為“血紅蛋白含量”，“血漿蛋白清除率”調(diào)整為“上清蛋白質(zhì)含量”，并增加了對(duì)洗滌紅細(xì)胞“溶血率”(≤0.8%)的要求。新國(guó)標(biāo)僅規(guī)定使用保存期內(nèi)的全血或懸浮紅細(xì)胞制備洗滌紅細(xì)胞，并未對(duì)原料血的儲(chǔ)存時(shí)間進(jìn)行規(guī)定。我們?cè)趯?duì)CPDA-1方全血制備的懸浮紅細(xì)胞儲(chǔ)存期內(nèi)溶血率調(diào)查中發(fā)現(xiàn)懸浮紅細(xì)胞溶血率隨儲(chǔ)存天數(shù)增加成進(jìn)行性增加，儲(chǔ)存期末溶血率指標(biāo)不符合率為1.25%［5］。因此，為了監(jiān)測(cè)以不同儲(chǔ)存時(shí)間懸浮紅細(xì)胞為原料制備的洗滌紅細(xì)胞的質(zhì)量，我們對(duì)不同保存時(shí)間的懸浮紅細(xì)胞所制備的洗滌紅細(xì)胞血紅蛋白含量、上清蛋白質(zhì)含量、血漿游離血紅蛋白含量進(jìn)行了檢測(cè)，同時(shí)分析產(chǎn)品溶血情況，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 一次性使用塑料血袋(山東威高，批號(hào):13070242)，四聯(lián)袋0.9%氯化鈉溶液(費(fèi)森尤斯卡比，批號(hào):85GG20AD004)，XS-500i血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(日本Sysmex公司)，M-300型半自動(dòng)生化分析儀(Vital Scientific公司)，PC203型分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，fresco離心機(jī)(SORVALL)，電熱恒溫水箱(北京市醫(yī)療設(shè)備廠)，血漿游離血紅蛋白試劑盒(Trinder法)(北京瑞爾達(dá)公司，批號(hào):150108);腦脊液與尿蛋白測(cè)定試劑盒(終點(diǎn)法)(北京利德曼公司，批號(hào):402201L)，大容量離心機(jī)(Thermo公司)，無(wú)菌管路對(duì)接機(jī)(日本Terumo公司)，電子天平(美國(guó)雙杰兄弟公司)。

1.2 方法

1.2.1 洗滌紅細(xì)胞的制備:將隨機(jī)采集400 ml CPDA-1保養(yǎng)液處方全血制備的2 U懸浮紅細(xì)胞120袋保存于(4±2)℃儲(chǔ)血專用冰箱，取儲(chǔ)存期第7、14、21、28和35天的懸浮紅細(xì)胞(無(wú)破損滲漏，血液外觀正常)各24袋。待用洗滌溶液聯(lián)袋提前放置冷凝保存，無(wú)破損滲漏，溶液外觀正常，在有效期內(nèi)。洗滌溶液聯(lián)袋分別為1號(hào)，2號(hào)，3號(hào)，4號(hào)，把1號(hào)和2號(hào)的鹽水全部擠入3號(hào)，4號(hào)，1號(hào)和2號(hào)排空待用。使用無(wú)菌接合機(jī)將待洗滌的紅細(xì)胞懸液袋導(dǎo)管和洗滌溶液聯(lián)袋進(jìn)行無(wú)菌接合連通，將洗滌溶液移至紅細(xì)胞袋內(nèi)，液體量約為100 ml，夾緊導(dǎo)管，混勻后3 500 r/min離心［溫度(4 ±2)℃］。離心后將血袋取出，避免震蕩，垂直放入分漿夾中，把上清液轉(zhuǎn)移至空袋內(nèi)，將洗滌溶液再次移至紅細(xì)胞袋內(nèi)，液體量約為150 ml，夾緊導(dǎo)管。經(jīng)上述步驟離心洗滌3次后加入適量 0.9%氯化鈉溶液(50 ml/U)移入已完成洗滌的紅細(xì)胞。將紅細(xì)胞混勻后注滿配血管，熱合留取40 cm配血管進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

血紅蛋白含量第28天與第35天、第7天與第35天比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其余各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。上清蛋白質(zhì)含量第21天與第28天比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其他各組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。溶血率第7天與第14天比較溶血率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，第7天、第14天與其他各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，第21天、第28天和第35天兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，第35天組有一例洗滌紅細(xì)胞的溶血率為0.85%，超出質(zhì)量控制要求。原料血第7天與第14天比較溶血率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，第7天、第14天與其他各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 不同儲(chǔ)存時(shí)間懸浮紅細(xì)胞制備的洗滌紅細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果 n=24，±s

表1 不同儲(chǔ)存時(shí)間懸浮紅細(xì)胞制備的洗滌紅細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果 n=24，±s

注:與7 d比較，*P＜0.05;與14 d比較，#P＜0.05;與21 d比較，△P＜0.05;與28 d比較，☆P＜0.05

項(xiàng)目 第7天 第14天 第21天 第28天 第35天Hb含量(g) 43.98±5.81 43.72±9.19 39.86±11.89 42.43±4.26 39.55±3.49＊☆上清蛋白質(zhì)含量(g) 0.36±0.12 0.46±0.20* 0.54±0.20*# 0.58±0.17*# 0.68±0.20*#△☆溶血率(%) 0.13±0.05 0.15±0.04 0.22±0.13*# 0.26±0.10*# 0.41±0.15*#原料血溶血率(%) 0.07±0.07 0.02±0.05* 0.13±0.08*# 0.27±0.11*#△ 0.48±0.19*#△☆

3 討論

洗滌紅細(xì)胞是采用特定的方法將保存期內(nèi)的全血、懸浮紅細(xì)胞用大量的等滲溶液進(jìn)行洗滌，去除了幾乎所有的血漿成分和部分非紅細(xì)胞成分，并用氯化鈉注射液或紅細(xì)胞添加液懸浮所制成的紅細(xì)胞成分血［4］。一般手工洗滌紅細(xì)胞可以去除紅細(xì)胞中90%左右的白細(xì)胞和99%以上的血漿蛋白。采用氯化鈉注射液懸浮制備的洗滌紅細(xì)胞可保存24 h，采用紅細(xì)胞保養(yǎng)液懸浮制備的洗滌紅細(xì)胞的保存期與普通紅細(xì)胞相同。洗滌紅細(xì)胞適用于輸全血或血漿蛋白過(guò)敏而又需要繼續(xù)輸血，自身免疫溶血性貧血、高鉀血癥及肝、腎功能障礙需要輸血、新生兒溶血病等患者。

血液保存在保養(yǎng)液中會(huì)發(fā)生紅細(xì)胞保存損傷，保存15 d以后的全血制備的洗滌紅細(xì)胞形態(tài)發(fā)生異常變化，出現(xiàn)棘形紅細(xì)胞，囊泡化后的紅細(xì)胞溶血，細(xì)胞壽命縮短影響洗滌紅細(xì)胞的質(zhì)量［7］。為避免留取的血樣儲(chǔ)存時(shí)間不同引起檢測(cè)結(jié)果的差異，我們將檢測(cè)時(shí)間均定為洗滌后1 h。表1顯示隨懸浮紅細(xì)胞儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，其制備的洗滌紅細(xì)胞的溶血率呈上升趨勢(shì)，其中第7天與第14天溶血率均值相近(P＞0.05)，該2組血液分別與其他各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其制備原料懸浮紅細(xì)胞第7天與第14天比較溶血率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，第7天、第14天與其他各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。第35天組溶血率較第28天組上升明顯，且有1例洗滌紅細(xì)胞的溶血率為0.85%，超出新國(guó)標(biāo)規(guī)定洗滌紅細(xì)胞溶血率＜RBC總量的0.8%的要求。有研究顯示，儲(chǔ)存期末溶血率指標(biāo)不符合率為1.1%［8］。FHb增加是血管內(nèi)溶血的指標(biāo)，F(xiàn)Hb含量是紅細(xì)胞制品質(zhì)量控制的重要指標(biāo)［9］，血液制品中過(guò)高的FHb可引起受血者急性腎功能衰竭等重副作用［10］。馮博等［11］的研究結(jié)果表明懸紅儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)所制備的洗滌紅細(xì)胞FHb影響較大，但對(duì)其制備的洗滌紅細(xì)胞的K+影響較小，原因可能是制備洗滌紅細(xì)胞的過(guò)程改變了紅細(xì)胞的滲透壓，導(dǎo)致紅細(xì)胞的溶血增加。有報(bào)道［12］稱手工制備洗滌紅細(xì)胞的RBC回收率可達(dá)到89.29%，Hb在RBC內(nèi)占有很大的比重，它的變化會(huì)直接影響紅細(xì)胞的形態(tài)［1］，并影響溶血率。表1中除第28天與第35天、第7天與第35天的血紅蛋白含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)外，其余各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。由此可見，應(yīng)用0.9%氯化鈉溶液對(duì)懸浮紅細(xì)胞進(jìn)行洗滌并未對(duì)Hb含量產(chǎn)生較明顯的影響。洗滌紅細(xì)胞的制備過(guò)程中因?yàn)楂I(xiàn)血者個(gè)體差異、洗滌的方法和步驟不同、制備人員的操作差異等均可能對(duì)洗滌紅細(xì)胞的溶血率產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定上清蛋白質(zhì)濃度使用的終點(diǎn)法即鄰苯三酚紅鉬絡(luò)合顯色法，數(shù)據(jù)顯示洗滌紅細(xì)胞的上清蛋白質(zhì)含量隨其原料懸浮紅細(xì)胞的儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸遞增，但均在新國(guó)標(biāo)要求范圍內(nèi)(＜1.0 g)。除第21天與第28天比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其他各組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。如果采用雙縮脲法測(cè)定上清液蛋白，只有非常靈敏的儀器方可達(dá)到要求［6］，因此應(yīng)用鄰苯三酚紅鉬絡(luò)合顯色法可檢測(cè)到上清液中的微量蛋白，結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

洗滌紅細(xì)胞制備過(guò)程中會(huì)丟失部分紅細(xì)胞［13］，王愛(ài)梅等［7］經(jīng)過(guò)對(duì)不同保存期血液制備成洗滌紅細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化，采用掃描電子顯微鏡觀察研究認(rèn)為，4℃保存10 d內(nèi)的全血最佳。因?yàn)?0 d內(nèi)的紅細(xì)胞形態(tài)具有完整的結(jié)構(gòu)和正常的生理功能，細(xì)胞膜能承受一定的離心壓力，輸注后能提高紅細(xì)胞的活力［7］。另有研究表明紅細(xì)胞隨儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)其攜氧能力不斷下降，庫(kù)存前2周其攜氧能力下降的尤為明顯，貯存35 d的紅細(xì)胞攜氧能力僅為0 d的50%［14］。本研究顯示洗滌紅細(xì)胞的上清蛋白質(zhì)含量和溶血率隨其制備原料懸浮紅細(xì)胞儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，與上述研究的結(jié)果一致。因此，使用儲(chǔ)存期較長(zhǎng)的懸浮紅細(xì)胞制成的洗滌紅細(xì)胞溶血率可能會(huì)超出國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

洗滌紅細(xì)胞制品成為臨床常用的血液用品，在非溶血性發(fā)熱反應(yīng)和血漿蛋白所致的過(guò)敏反應(yīng)應(yīng)用中起著不可替代的作用。目前廣泛應(yīng)用的CPDA保養(yǎng)液對(duì)ATP的保存效果明顯優(yōu)于ACD和CPD保養(yǎng)液。紅細(xì)胞輸入患者體內(nèi)24 h后，其存活率一般要求大于75%。紅細(xì)胞保存過(guò)程中重要的變化就是紅細(xì)胞中ATP水平降低。在CPDA保養(yǎng)液中，腺嘌呤可先合成AMP，進(jìn)一步磷酸化生成ATP，可有效促進(jìn)紅細(xì)胞代謝［15］。我們?cè)趯?duì)CPDA-1方全血制備的懸浮紅細(xì)胞和去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞儲(chǔ)存期內(nèi)溶血率的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，2組紅細(xì)胞均采用CPDA-1保養(yǎng)液，懸浮紅細(xì)胞組溶血率優(yōu)于ACD-B保養(yǎng)液采集的懸浮紅細(xì)胞［5］，這與一些研究的結(jié)果［16］是一致的。《血站技術(shù)操作規(guī)程》(2012版)中提出通過(guò)導(dǎo)管接駁技術(shù)制備的洗滌紅細(xì)胞，并且以紅細(xì)胞保存液混懸，可以延長(zhǎng)洗滌紅細(xì)胞保存期。添加MAP紅細(xì)胞保存液延長(zhǎng)了洗滌紅細(xì)胞的保存期，使其更加廣泛的應(yīng)用于臨床。

綜上所述，懸浮紅細(xì)胞儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)制備的洗滌紅細(xì)胞質(zhì)量有較大影響，洗滌紅細(xì)胞的上清蛋白質(zhì)含量和溶血率隨其制備原料懸浮紅細(xì)胞儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。14 d內(nèi)的懸浮紅細(xì)胞制備的洗滌紅細(xì)胞的上清蛋白質(zhì)含量和溶血率均較低，使用保存期較長(zhǎng)的懸浮紅細(xì)胞制備的洗滌紅細(xì)胞產(chǎn)品溶血率可能會(huì)超出國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。因此，建議血站盡量選擇儲(chǔ)存期在14 d內(nèi)的懸浮紅細(xì)胞用于制備洗滌紅細(xì)胞，以避免使用儲(chǔ)存期末懸浮紅細(xì)胞制備洗滌紅細(xì)胞而導(dǎo)致臨床輸注效果下降。另外，在添加MAP紅細(xì)胞保存液的洗滌紅細(xì)胞也盡量縮短保存期，以減少一些特殊患者如高鉀血癥患者的副作用［17］。

1 楊成民，李家增，季陽(yáng)主編.基礎(chǔ)輸血學(xué).第1版.北京:中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，2001.668.

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3 張艷華，李廣慶，陳蘭蘭，等.制備洗滌紅細(xì)胞方法關(guān)鍵控制點(diǎn)改進(jìn)體會(huì).河北醫(yī)藥，2011，33:622-623.

4 GB18469-2012.全血及成分血質(zhì)量要求.

5 李美霖，車進(jìn)，張燕華，等.CPDA-1方全血制備的懸浮紅細(xì)胞和去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞儲(chǔ)存期內(nèi)溶血率的調(diào)查.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2014，30: 3034-3035.

6 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部主編.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程.第1版.南京:東南大學(xué)出版社，2006.342-344.

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14 張婷，潘紀(jì)春，莊遠(yuǎn)，等.不同保存時(shí)間的庫(kù)存紅細(xì)胞攜氧能力變化研究.中國(guó)輸血雜志，2013，26:434-438.

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17 馮博，段瀾，任芙蓉，等.用于高鉀血癥貧血患者的洗滌紅細(xì)胞可保存時(shí)間的研究.中國(guó)輸血雜志，2014，28:123-125.