免疫親和-HPLC 法測定嬰幼兒配方乳粉中維生素B12

黃 娟，盧沛明

(國家青少年食品質量監督檢驗中心/中食檢測研究院有限公司，廣東東莞 520808)

維生素B12是唯一一類含有主要礦物質鈷的維生素，故又名鈷胺素，包括氰鈷胺、羥鈷胺、甲鈷胺、腺苷鈷胺。通常狹義上所指維生素B12是氰鈷胺，它是食品和營養補充劑中B12的主要形式。B12易溶于水，在吸收時需要與鈣結合，大部分為小腸所吸收，人體只能利用甲鈷胺和腺苷鈷胺，因此氰鈷胺要在體內細胞轉化成這兩種形式才能被人體吸收利用。嬰幼兒缺乏維生素B12表現為精神情緒異常、表情呆滯、反應遲鈍等，最后導致貧血［1］;嬰幼兒過量攝入維生素B12則易導致葉酸缺乏，有些會出現哮喘、濕疹、蕁麻疹、面部水腫等過敏性癥狀。因此我國標準對嬰幼兒品配方乳粉中B12的添加量有嚴格的規定，其中GB 14880—2012《食品安全國家標準 食品營養強化劑使用標準》［2］中兒童調制乳粉中B12的添加量為10～30μg/kg，相關產品國標標準添加限量也在此范圍。目前市售嬰幼兒乳粉是營養標簽中B12的含量大部分在1.5～2.5μg/100g 之間。

現行標準GB 5413.14—2010《嬰幼兒食品和乳制品中維生素B12測定方法》［3］采用微生物法，但由于測定周期長、技術難度較大等缺點，大部分的檢驗機構不能較好地開展。而另一現行標準GB/T 5009.217—2008 《保健食品中維生素B12的測定》［4］的前處理過于簡單，對嬰幼兒乳粉的除雜、提取效果不佳，檢出限(0.05μg/g)達不到要求，因此也不適用。筆者根據嬰幼兒乳粉的成分特點，對GB/T 5009.217—2008 的前處理過程進行改進，降低了基體雜質的干擾，提高了檢測的靈敏度，實驗過程簡單易掌握，能滿足日常嬰幼兒乳粉中B12含量的檢測要求。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 高效液相色譜儀(U-3000，美國Thermofisher 公司)，帶紫外檢測器;離心機(Sorvall ST16，美國Thermofisher 公司);氮吹儀(DC-24，上海安譜科學儀器有限公司);固相萃取裝置(20-Positiion Extraction Manifold，Waters 公司);免疫親和柱(EASI-EXTRACT vitaminB12，60mg，3mL，德國拜發公司)。

1.1.2 試劑 乙腈(色譜純，Honeywell)、甲醇(色譜純，Honeywell)乙酸鈉(AR，廣州試劑廠)、三氟乙酸(AR，廣州試劑廠);維生素B12標準品(96.2%，Dr.Ehrenstorfer)。

1.2 色譜條件

色譜柱:Hypersil GOLD 250 ×4.6mm，5μm;柱溫30℃;流動相:乙腈和水(15∶85)，梯度洗脫(表1);流速0.25mL/min;紫外檢測器361nm，進樣量10μL。

表1 流動相梯度

1.3 樣品前處理

稱取試樣5.000g (精確到0.001g)于50mL 容量瓶中，加入30mL 乙酸鈉緩沖溶液(50mmol/L，pH4.0，40℃)振搖混勻后，用乙酸鈉緩沖溶液定容。超聲提取15min，然后將提取液用濾紙過濾，取濾液30mL 待凈化。免疫親和柱放置在固相萃取裝置上，待柱中原緩沖溶液流完時立即倒入濾液，以2mL/min 的速度流出，棄去流出液，并用10mL 純水以5mL/min 的速度洗滌柱子，待水流完，用洗耳球吹干免疫親和柱。用5mL 甲醇以1 滴/s 的速度洗脫目標物，并置于氮吹儀上(60℃)吹干。加200μL 純水定容后上機。標準品譜圖見圖1、樣品譜圖和加標樣譜圖見圖2。

圖1 維生素B12標準品譜圖

圖2 乳粉中維生素B12譜圖(A 圖為樣品、B 圖為加標樣)

2 檢測條件的優化

2.1 流動相的選擇

按照GB/T 5009.217—2008 中流動相為0.025%三氟乙酸(pH 值為2.6)和乙腈，筆者將0.025%三氟乙酸(pH 值=2.6)換成純水，實驗結果顯示目標物的相應沒有發生明顯的變化。考慮到流動相pH 偏低對色譜柱的壽命有影響，故將流動相調整為水和乙腈。

2.2 流速的選擇

通常高效液相色譜的流動相流速為1mL/min，筆者嘗試比較不同流速時目標物的相應發現，隨著流動相流速的降低，目標物的靈敏度和響應顯著增加(圖3)。相同濃度的標準品，在不同流速下，標準品的峰高從1.855 上升到2.690，峰面積也增加110%。考慮到實驗總消耗時限，選擇0.25mL/min 作為最終方法確認的實驗條件。

圖3 不同流動相流速時維生素B12譜圖

3 結果與分析

3.1 線性范圍和檢出限

稱取標準物質，5%乙醇水配制濃度為1mg/mL 的標準儲備溶液，然后用水稀釋成濃度為0、0.01、0.02、0.10、0.20、0.50、1.00μg/mL 的標準工作溶液。以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標得到標準曲線Y=0.520 8 +0.000 7，相關系數r=0.999 9，說明在0.01～1μg/mL范圍內具有良好的線性關系。噪比為3 時，樣品中最低檢出濃度為5μg/kg。

3.2 準確性

取嬰幼兒乳粉樣品，按照1.3 中步驟處理樣品，同時進行3 個水平加標實驗(表2)，測定樣品的加標回收率80.0%～90.0%，符合GB 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》附錄F 中＜0.1mg/kg 的組分含量回收率范圍在60%～120%的要求。

表2 回收率測定結果

3.3 方法的重復性與穩定性

取不同濃度的樣品分別進行測定6 次(表3)，測定結果的相對標準偏差(RSD)為0.3%～1.6%，說明本方法重復性好。將處理好的樣品放入4℃的冰箱中避光保存，在12h 內測定結果未見有顯著性差異。

表3 不同濃度樣品重復測定結果

4 討論

本文所建立的免疫親和—高效液相色譜法較微生物檢驗方法來說，易于操作和掌握，重復性和穩定性較好，流動相的變化更有利于延長色譜柱的使用壽命，檢出限能滿足日常嬰幼兒乳粉的檢測，能應用在日常檢驗工作中，大大提高工作效率。

［1］王華，陳輝，李雪梅，等.維生素B12功能及營養作用研究［J］.中國食物與營養，2007，2:57-58.

［2］GB 14880—2012 食品安全國家標準 食品營養強化劑使用標準［S］.

［3］GB 5413.14—2010 嬰幼兒食品和乳制品中維生素B12測定方法［S］.

［4］GB/T 5009.217—2008 保健食品中維生素B12的測定［S］.