缺血后處理對大鼠心肌缺血/再灌注不同時相損傷營救激酶及線粒體通透性轉換孔的影響

肖　軍,黎　立,姜振宇,史迎昌,孫佳增,劉維全,孫慧娜,陶耀兵

(1.解放軍第三○九醫院 a.心內科,b.動物實驗中心，北京新技術公司100091; 2.中國農業大學生物學院，北京 100091)

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缺血后處理對大鼠心肌缺血/再灌注不同時相損傷營救激酶及線粒體通透性轉換孔的影響

肖軍1a,黎立1b※,姜振宇1b,史迎昌1b,孫佳增2,劉維全2,孫慧娜1a,陶耀兵1a

(1.解放軍第三○九醫院 a.心內科,b.動物實驗中心，北京新技術公司100091; 2.中國農業大學生物學院，北京 100091)

再灌注治療是挽救缺血心肌細胞的最有效方法，但同時也可導致再灌注損傷[1]。2003年，Zhao等[2]進行犬實驗并提出缺血后處理的概念：在冠狀動脈再灌注開始時實行短暫、重復的開通及再閉(冠狀動脈3輪30 s阻塞/30 s再灌注)，隨后恢復冠狀動脈血流，對改善心肌再灌注損傷有益。研究證實，缺血后處理的心肌保護作用與其抑制線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)開放和激活再灌注損傷營救激酶途徑有關[3]。本研究應用近交系Lewis大鼠頸部異位心臟移植左心作功心肌梗死模型，探討缺血后處理對大鼠移植心臟心肌缺血/再灌注不同時相再灌注損傷營救激酶途徑與mPTP的影響。

1材料與方法

1.1大鼠頸部異位心臟移植左室作功模型制備供受者Lewis大鼠240只(健康雄性近交系，RT-11,合格證號：SCXK-2012-0004,無特定病原體動物級，體質量250～300 g,鼠齡 8～10周，由解放軍總參總醫院實驗動物中心提供)。供心主動脈與受體右頸總動脈的單線連續端側吻合，供心右上腔靜脈與受體右頸外靜脈的單線連續端端吻合，供心主肺動脈與左心耳行端側吻合[4-5]。

1.2動物分組及處理120只受體大鼠存活2 d后，肌內注射速眠新(8 mL/kg)全身麻醉。采用隨機數字表法分為移植心臟缺血/再灌注組、缺血后處理組和假手術組，其中假手術組8只大鼠，其余兩組分別為56只，每個時相點8只。①缺血/再灌注組(再灌注3、6、12、24 h及2、4、7 d)：用無損傷針在移植心左冠前降支下(以左冠狀動脈主干為標志，在左心耳部下方2 mm處進針，3-0絲線穿過心肌表層在肺動脈圓錐旁出針)穿線并通過內徑1 mm的乳膠管，收緊線完全阻斷左冠狀動脈前降支30 min，松解線使血管得到充分再灌注。②缺血后處理組(再灌注3、6、12、24 h及2、4、7 d)：在再灌注前1 min內，迅速給予短暫再通10 s，隨之再次阻斷10 s，此為1個循環，重復3個循環，共計60 s的后處理循環。③假手術組(假手術24 h)：穿線做套環，但不收緊結扎線。1-0絲線單層關閉切口。術后每日肌內注射青霉素(2萬U/kg)和鏈霉素(15 mg/kg)預防感染共3 d。單籠飼養，每日觀察大鼠精神狀態，通過視診和觸診觀察移植心臟的搏動情況。

1.3心肌梗死范圍的測定經主動脈逆行灌注0.5% Evan′s藍2～3 mL，游離左心室稱重，將無藍染缺血心肌以濾紙吸干后稱重，置于-20 ℃冰凍20 min，將冰凍心臟從心尖至心底橫向切成薄片(每片厚度1 mm)5～6片，并浸入37 ℃ 1%氯化三苯基四氮唑磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中孵化30 min。壞死區呈灰白色，非壞死區呈深紅色，梗死范圍以壞死心肌重量與缺血心肌重量之比表示。

1.4磷酸化蛋白激酶B/蛋白激酶B(phosphorylation of protein kinase B/AKT，p-AKT)與細胞外信號調節激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,p-ERK1/2)蛋白表達檢測磷酸化蛋白激酶B/AKT、p-ERK1/2用Western blot法，參照文獻[6]。

1.5mPTP開放程度檢測用分光光度計法，參照文獻[6]。用ΔA=ΔA1-ΔA2表示mPTP開放程度，ΔA越小，mPTP開放程度越大。

2結果

2.1心肌梗死范圍在再灌注7個時相點，缺血后處理組心肌梗死范圍均顯著低于相同時間點缺血/再灌注組,差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01),見表1。

表1　兩組大鼠再灌注不同時相心肌梗死范圍的比較　±s，n=8，%)

2.2心肌細胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達假手術組心肌細胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達水平分別為(0.44±0.04)和(0.61±0.10)，在再灌注7個時相點，缺血后處理組和缺血/再灌注組心肌細胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達顯著高于假手術組(均P<0.01)。在再灌注7個時相點，缺血后處理組心肌細胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達明顯高于相同再灌注時間的缺血/再灌注組(P<0.05)，缺血/再灌注組與缺血后處理組的心肌細胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達峰值時間在再灌注24 h。見表2。

2.3心肌細胞mPTP開放程度假手術組心肌細胞線粒體吸光度ΔA為(0.63±0.02)，在再灌注7個時相點，缺血后處理組和缺血/再灌注組心肌細胞線粒體吸光度ΔA著顯低于假手術組(均P<0.01)。在再灌注7個時相點，缺血后處理組心肌細胞線粒體吸光度ΔA著顯高于相同再灌注時間的缺血/再灌注組(P<0.01)，缺血再灌注組與缺血后處理組的心肌細胞線粒體吸光度ΔA峰值時間在再灌注24 h。見表2。

表2　兩組大鼠再灌注不同時相數據比較　±s，n=8)

p-ERK1/2：細胞外信號調節激酶1/2;p-AKT：磷酸化蛋白激酶B/AKT；缺血后處理組和缺血/再灌組各時相間比較及與假手術組比較，均P<0.05；“-”未檢測

3討論

20世紀80年代中期，Murry等[7]提出心肌在經受多次短暫缺血/再灌注后，能在隨后的長時間缺血中延遲并減輕心肌損傷，即缺血預處理。Marber等[8]的實驗在缺血預處理研究史上是一個重大突破，發現由缺血刺激引發兩個不同保護窗,第一個保護窗在缺血預處理后即可產生，并于2～3 h后逐漸減弱，取而代之的第二保護窗(保護強度弱于第一窗)于12～24 h開始出現，并持續2～3 d。2003年，Zhao等[2]在犬冠狀動脈再灌注實行短暫(開閉各30 s)、重復(3次)的開通及再閉，隨后恢復冠狀動脈血流，可減少約44%的心肌梗死面積，減少心肌水腫，減少中性粒細胞的聚集，減少細胞凋亡和改善內皮細胞，提出了缺血后處理的概念[9]。目前研究認為，缺血后處理的心肌保護機制與缺血預處理相似，但是兩者有明顯不同，預缺血處理在心肌缺血之前，缺血后處理在心肌梗死后。對于缺血后處理的認識遠沒有對于缺血預處理的認識清楚，大多數文獻報道缺血后處理對缺血/再灌注的心肌保護作用局限于心肌再灌注6 h內。Mykytenko等[10]比較再灌注24 h與3 h的心肌梗死范圍，發現后處理在再灌注晚期(24 h)仍具有縮小心肌梗死面積作用，但并未進行系列時間節點的比較，也未對機制進行深入探索。

本研究應用近交系Lewis大鼠頸部異位心臟移植左心作功心肌梗死模型，移植心臟相當于在體的Langendorff模型，解決了傳統在體模型動物死亡率較高的問題，也保證了(冠狀動脈被結扎)移植心臟得到長期較好的灌注，同時避免了移植心臟左心萎縮和血栓。本實驗供受者為近交系Lewis大鼠，屬同基因心臟移植，因而沒有免疫排斥反應問題。本研究動態觀測大鼠移植心臟心肌梗死范圍、心肌細胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達及心肌細胞mPTP開放程度在不同再灌注時間點的數值。在再灌注時間3、6、12、24 h及2、4、7 d，與假手術組比較，缺血/再灌注組和缺血后處理組心肌細胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達顯著增高(P<0.01)，心肌細胞mPTP開放程度增高(P<0.01)，提示再灌注損傷營救激酶途徑及心肌細胞mPTP開放在心肌缺血/再灌注損傷中起重要作用。與缺血/再灌注組比較，缺血后處理組在7個時相點的心肌細胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達顯著增高(P<0.05)，心肌細胞mPTP開放程度降低(P<0.01)，心肌梗死范圍顯著縮小(P<0.05)，提示缺血后處理能在再灌注早期(3 h)升高心肌細胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白的表達，有效抑制心肌細胞mPTP開放，有效縮小心肌梗死范圍，并持續到再灌注晚期(7 d)。缺血/再灌注組與缺血后處理組的心肌細胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達峰值時間和心肌細胞mPTP開放程度谷值時間在再灌注24 h，提示缺血后處理不能改變心肌細胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白的表達達峰時間及mPTP開放程度達谷時間。本研究表明，缺血后處理能減輕心肌缺血/再灌注損傷的程度，但不能改變(加速或延遲)心肌缺血/再灌注損傷的進程。

缺血后處理是近年來國際上提出的心肌保護全新理念，作為一種內源性心肌保護機制具有重大的研究價值和應用價值。本研究提示，缺血后處理在大鼠心肌缺血/再灌注3 h～7 d內能有效升高心肌細胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白的表達，有效抑制心肌細胞mPTP開放，有效縮小心肌梗死范圍。缺血后處理對心肌缺血/再灌注損傷的這種持續保護作用應受到重視，其機制有待深入研究。

參考文獻

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[4]郭宏偉,吳清玉,謝蜀生,等.左心作功的大鼠腹部心臟移植模型的建立[J].中華實驗外科雜志,2001,18(2):188.

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[10]Mykytenko J,Kerendi F,Reeves JG,etal.Long-term inhibition of myocardial infarction by postconditioning during reperfusion[J].Basic Res Cardiol,2007,102(1):90-100.

摘要：目的探討缺血后處理對大鼠心肌缺血/再灌注不同時相損傷營救激酶及線粒體通透性轉換孔(mPTP)的影響。方法建立近交系Lewis大鼠頸部異位心臟移植左心作功模型， 120只受體大鼠存活2 d后，采用隨機數字表法分為移植心臟缺血/再灌注組、缺血后處理組和假手術組，其中假手術組8只，其余兩組分別為56只，每個時相點8只，在再灌注3、6、12、24 h及2、4、7 d分別檢測移植心臟心肌細胞磷酸化蛋白激酶(p-AKT)、細胞外信號調節激酶1/2(p-ERK1/2)蛋白表達、mPTP開放程度和心肌梗死范圍。結果在再灌注的7個時相點，缺血后處理組與再灌注組心肌細胞p-AKT與p-ERK1/2蛋白表達及mPTP開放程度對應比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)，兩組蛋白表達及mPTP開放程度均明顯高于假手術組(均P<0.05)；缺血后處理組心肌梗死范圍顯著小于再灌注組(P<0.05或P<0.01)。結論缺血后處理在大鼠移植心臟心肌缺血/再灌注3 h至7 d內能有效升高心肌細胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白的表達，抑制心肌細胞mPTP開放，縮小心肌梗死范圍。

關鍵詞:缺血后處理；缺血/再灌注損傷；心肌/再灌注損傷營救激酶；線粒體通透性轉換孔

Effect of Ischemic Postconditioning on the Reperfusion Injury Salvage Kinase and Mitochondrial Permeability Transition Pore at Different Time Phases of Myocardial Ischemia-reperfusionon in RatsXIAOJun1a,LILi1b,JIANGZhen-Yu1b,SHIYing-Chang1b,SUNJia-zheng2,LIUWei-Quan2,SUNHui-Na1a,TAOYao-Bing1a.(1a.DepartmentofCardiology, 1b.CenterforAnimalExperiment,309thHospitalofChinesePLA,Beijing100091,China; 2.CollegeofBiologicalSciences,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100091,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the effects of ischemic postconditioning on the reperfusion injury salvage kinase and the opening of mitochondrial permeability transition pore(mPTP) at different time phases of myocardial ischemia-reperfusion injury in rats.MethodsIsogenic adult Lewis rat models of cervical heterotopic and working-heart transplantation were established. The 120 recipients were divided into ischemia-reperfusion group，ischemic postconditioning group and sham operation group,8 rats in the sham operation group, 56 in the other two groups respectively,8 for each time phase point.Myocardial infarction size,expression of p-AKT and p-ERK1/2 protein and the opening of mPTP were measured respectively at 3, 6, 12,24-hour and 2,4, 7-day after reperfusion.ResultsThe expression of p-AKT and p-ERK1/2 protein and the opening of mPTP were statistically significant different between the ischemia-reperfusion group and ischemic postconditioning group at 7 time points after reperfusion(P<0.05),while both of which were higher than the sham operation group.The myocardial infarction range of the postconditioning group was less than the ischemia-reperfusion group(P<0.05).ConclusionIschemic postconditioning can increase the expression of p-AKT and p-ERK1/2 protein，decrease the opening of mPTP and myocardial infarction range between 3 hours and 7 days after the reperfusion after myocardial ischemia in rats.

Key words:Ischemic postconditioning; Myocardial ischemia-reperfusion injury; Reperfusion injury salvage kinase; Mitochondrial permeability transition pore

收稿日期：2014-09-01修回日期：2014-11-27編輯：伊姍

基金項目：北京市自然科學基金(7122178)

中圖分類號：R541.4
doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.05.046

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)05-0890-03