Pin1抑制劑胡桃醌對乳腺癌細胞株MCF7Adr增殖、遷移及血管新生能力的影響

王　紅

(荊州市婦幼保健院藥劑科,湖北 荊州 434020)

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Pin1抑制劑胡桃醌對乳腺癌細胞株MCF7Adr增殖、遷移及血管新生能力的影響

王紅

(荊州市婦幼保健院藥劑科,湖北 荊州 434020)

摘要：目的研究Pin1抑制劑胡桃醌對乳腺癌細胞株MCF7Adr增殖、遷移及血管新生能力的影響。方法培養乳腺癌細胞株MCF7Adr，分別用不含藥物的DMEM(對照組)、Pin1抑制劑胡桃醌處理(處理組)，采用流式細胞法檢測細胞周期、劃痕實驗檢測細胞的遷移能力、Western-blot檢測Cyclin E的蛋白含量、酶聯免疫吸附法檢測細胞上清液中血管內皮生長因子(VEGF)的水平。結果處理組的G2/M期比例高于對照組(t=21.848，P<0.01)，G0/G1比例、S期比例低于對照組(t=6.234，6.658，均P<0.05)，Cyclin E蛋白含量、(A0-A24)/A0值低于對照組(t=17.586，26.679，均P<0.01)，處理組細胞的上清液中VEGFA、VEGFB、VEGFC水平低于對照組(t=15.237，13.894，16.382，均P<0.01)。結論Pin1抑制劑胡桃醌能有效抑制乳腺癌細胞株MCF7Adr的增殖、遷移和血管新生能力，Pin1抑制劑可作為乳腺癌治療的備選藥物。

關鍵詞：乳腺癌；Pin1抑制劑；細胞周期；血管新生

Pin1(Peptidyl-Prolyl Cis/Trans Isomerase NIMA-interating)是一類在惡性腫瘤形成過程中發揮重要作用的肽脯氨酰順反異構酶，也是近年來發現的惡性腫瘤治療靶點。胡桃醌(Juglone)是從胡桃楸的新鮮根皮、枝皮、青果皮中分離出來的羥基萘醌類化合物，是通過高通量篩選方法發現的第1個Pin1的抑制劑[1]。鼻咽癌、宮頸癌、食管癌的體外研究均證實了胡桃醌對惡性腫瘤的抑制作用[2-4]。乳腺癌是女性發病率最高的惡性腫瘤，在臨床治療時多采用手術切除、化療、生物治療等綜合療法。常規的化療藥物具有較強的不良反應，且容易產生抗藥性，整體的化療效果并不理想[5]。本研究主要分析Pin1抑制劑胡桃醌對乳腺癌細胞株MCF7Adr增殖、遷移及血管新生能力的影響，現報道如下。

1材料與方法

1.1材料乳腺癌細胞株MCF7Adr購于中科院細胞庫；杜爾伯科極限必需培養基(Dulbecco minimum essential medium，DMEM)和胎牛血清均購于美國Sigma公司；抗體購買于英國Abcam公司；離心管和細胞培養板購于美國Corning公司；Pin1抑制劑胡桃醌購于美國Sigma公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養方法凍存在液氮罐中的細胞取出后迅速投入37 ℃水浴鍋中震蕩，離心后重懸細胞并種在15 cm2的培養瓶中培養，當細胞鋪滿培養瓶底面80%～90%時進行傳代處理，分別接種于培養瓶和12孔培養板中。培養瓶中的細胞用于下一次傳代，而12孔培養板中的細胞用于藥物處理。

1.2.2細胞處理方法當12孔培養板中的細胞鋪滿70%～80%時，將培養基換為不含胎牛血清的DMEM并處理24 h，使每孔細胞生長同步化，而后用不含藥物的DMEM處理(對照組)、30 μmol/L 胡桃醌處理(處理組)。藥物處理24 h后進行相關檢測。

1.2.3細胞周期測定胰酶消化細胞后離心，用含有10%胎牛血清的PBS溶液300 μL重懸細胞，加入700 μL無水乙醇固定過夜，第2日離心并用PBS清洗2遍，而后用碘化丙啶染色，上流式細胞儀檢測細胞周期指標。

1.2.4細胞遷移能力測定采用劃痕實驗測定遷移能力，方法如下：藥物處理前用200 μL移液管頭在細胞板的中央做一劃痕，立即在顯微鏡下觀察并拍照記錄，設定為0 h；藥物處理24 h再次在顯微鏡下觀察并拍照記錄，設定為24 h。用Image J軟件對0 h和24 h的圖像進行分析，計算劃痕的面積并分別記錄為A0和A24，代入(A0-A24)/A0求出細胞的遷移能力。令對照組細胞的遷移能力為100，求出處理組細胞遷移能力的相對值。

1.2.5Western-blot檢測按照RIPA裂解液和苯甲基磺酰氟化物100∶1的比例配制裂解液，在細胞孔中加入60 μL后充分裂解細胞、提取蛋白，離心后取上清按每份10.4 μL分裝，并在每管中加入上樣緩沖液4 μL、二巰基蘇糖醇1.6 μL，置于100 ℃變性10 min。蛋白變性時，配置4%的濃縮膠和10%的分離膠，待變性結束將樣本加入點樣孔中進行垂直電泳(90 V、20 min，120 V、80 min)和電轉膜(100 V、90 min)。轉膜完成后取出硝酸纖維素膜(NC膜)并用5%脫脂牛奶封閉過夜(4 ℃)，第2日取出NC膜，用TBST(含有Tris-HCl，NaCl，tween20這3種物質的緩沖液)洗滌3遍，根據marker指示的蛋白位置裁剪NC膜，分別孵育Cyclin E、actin第一抗體，過夜后取出NC并膜置于TBST溶液中洗滌3遍，而后用辣根過氧化物酶標記的第二抗體進行孵育，1 h后再次用TBST洗滌3遍，最后進行顯影。計算蛋白條帶的灰度值，以目的基因的灰度值/內參actin灰度值作為蛋白含量，令空白對照組的蛋白含量作為100，計算處理組目的基因的蛋白含量。

1.2.6血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)檢測收集藥物處理過的細胞上清液，采用上海邦奕公式的酶聯免疫吸附試劑盒A(貨號DRE11354)、VEGFB(貨號DRE10433)、VEGFC(貨號DRE10430)檢測VEGF不同亞型的水平。

2結果

2.1細胞增殖情況處理組細胞的G0/G1比例為(34±7)%、S期比例(31±6)%，低于對照組的G0/G1比例(45±8)%、S期比例(45±9)%(t=6.234，P=0.018；t=6.658，P=0.015)；處理組G2/M期比例為(36±6)%，高于對照組的G2/M期比例(10±3)%(t=21.848，P<0.01)；處理組Cyclin E蛋白含量為(39±7)%，低于對照組的(100±23)%，差異有統計學意義(t=17.586，P<0.01)。見圖1。

圖1　不同處理條件下MCF7Adr細胞的細胞周期檢測

2.2細胞遷移能力處理組的(A0-A24)/A0值為(25±4)，低于對照組的(100±19)，差異有統計學意義(t=26.679，P<0.01)，見圖2。

圖2　不同處理條件下MCF7Adr細胞的遷移能力檢測結果

2.3血管新生指標處理組的VEGFA、VEGFB、VEGFC水平低于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，見表1。

表1兩組細胞上清液中VEGF水平比較

(±s，ng/mg)

VEGF：血管內皮生長因子

3討論

Pin1是一類肽脯氨酰順反異構酶，能夠特異性地識別磷酸化的絲/蘇脯氨酰基序列，再由PPlase結構域使目標蛋白發生順反異構反應，進而調節蛋白的生物學功能。近年來的研究發現，Pin1在食管癌、子宮內膜癌以及胃癌組織中均呈現高表達，且與疾病的預后情況密切相關[6-8]。c-Jun、c-myc、p53、核因子κB、Cyclin E等多種惡性腫瘤相關的蛋白均是Pin1的作用底物，Pin1高表達會激活腫瘤細胞無限增殖、浸潤性生長等惡性生物學行為的產生，而Pin1選擇性的抑制劑和siRNA均可以有效地抑制腫瘤生長。胡桃醌是通過高通量篩選方法發現的第一個Pin1的抑制劑，從胡桃楸的新鮮根皮、枝皮、青果皮中分離出來，對肽酰-脯氨酰同分異構酶家族成員均具有不可逆的抑制作用。目前，在鼻咽癌、宮頸癌、食道癌樣本中進行的體外研究均證實了胡桃醌可以抑制惡性腫瘤細胞的增殖[9-10]；而周金華等[11]在乳腺癌MCF-7細胞株中的研究顯示，通過反義核酸敲低Pin1的表達后可以阻斷乳腺癌細胞的細胞周期，是乳腺癌基因治療的潛在靶點。

本研究采用Pin1抑制劑胡桃醌來處理乳腺癌細胞株MCF7Adr，并從細胞增殖、遷移以及血管新生情況3個方面分析了胡桃醌對惡性腫瘤的抑制作用。乳腺癌發生局部復發和遠處轉移的根本原因在于惡性腫瘤細胞的無限增殖以及浸潤性生長。本研究通過比較處理組和對照組之間的增殖能力和遷移能力來反映惡性腫瘤細胞的無限增殖以及浸潤性生長情況。通過流失細胞術檢測細胞周期可顯示，Pin1抑制劑胡桃醌可以使細胞增殖停滯于G2期，表現為G2/M期的比例顯著增加、而G0/G1期和S期的比例顯著減少，說明Pin1抑制劑胡桃醌能抑制乳腺癌細胞的增殖過程。通過劃痕實驗的結果分析可知，處理組的(A0-A24)/A0值顯著低于對照組，說明Pin1抑制劑胡桃醌能有效抑制乳腺癌細胞的遷移過程。

細胞的增殖過程受到一系列細胞周期蛋白的調控，不僅直接表現為G0期細胞數目增多，也與細胞遷移能力的增強、浸潤性生長細胞數目的增多密切相關[11]。在眾多細胞周期蛋白中，Cyclin E是體內一類十分重要的細胞周期蛋白，在細胞增殖的G1/S期表達，通過與細胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase，CKD2)結合并形成Cyclin E-CKD2復合物，CKD2激活后可調節細胞由G1期向S期過渡[12]。在惡性腫瘤細胞中，Cyclin E過度表達可使CKD2持續性激活，并促進腫瘤細胞的不斷增殖[13]。通過Western-blot的方法檢測Cyclin E蛋白含量來反映乳腺癌細胞的增殖能力可知，處理組的Cyclin E蛋白含量低于對照組，進一步說明Pin1抑制劑胡桃醌能通過下調細胞周期蛋白Cyclin E來抑制細胞增殖的過程。

事實上，乳腺癌細胞無限增殖、浸潤性生長等惡性生物學行為的完成依賴局部新生血管形成所提供的氧氣和養分[14]。在這一過程中，瘤體周圍新生血管的形成可以帶來耗能過程所需要的氧氣、葡萄糖等[15]。近年來的研究認為，惡性腫瘤瘤體本身具有極強的內分泌功能，可以產生大量的細胞因子來介導血管新生的過程，其中VEGF是目前為止已知作用最為明確的一類促血管新生細胞因子，其水平可以直接反映腫瘤細胞新生血管的能力[16-17]。在本研究所培養的MCF7Adr細胞株中，VEGF在合成后分泌進入細胞上清液進而發揮生物學作用，通過檢測上清液中VEGF三種亞型的水平可知，處理組的VEGFA、VEGFB、VEGFC水平低于對照組，說明Pin1抑制劑胡桃醌能顯著抑制乳腺癌細胞株MCF7Adr的血管新生能力。

綜上所述，Pin1抑制劑胡桃醌能有效抑制乳腺癌細胞株MCF7Adr的增殖、遷移和血管新生能力，Pin1抑制劑可作為乳腺癌治療的備選藥物。

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Effect of Pin1 Inhibitor Juglone on Proliferation,Migration and Angiogenic Ability of Breast Cancer Cell Line MCF7AdrWANGHong.(DepartmentofPharmacy,JingzhouWomenandChildren′sHospital,Jingzhou434020,China)

Abstract:ObjectiveTo study the effects of Pin1 inhibitor Juglone on proliferation,migration and angiogenic ability of breast cancer cell line MCF7Adr.MethodsBreast cancer cell line MCF7Adr were cultured and separately treated with DMEM without drug(control group),and Pin1 inhibitor Juglone (treatment group).Cell cycle was detected by flow cytometry,cell migration was detected by wound-healing assay,Cyclin E protein content was detected by Western-blot,and angiogenesis factor vascular endothelial growth factor (VEGF) in cell media were detected by enzyme linked immunosorbent assay.ResultsG2/M phase percentage of the treatment group was higher than that of the control group(t=21.848，P<0.01);G0/G1percentage,S stage percentage of the treatment group were lower than those of the control group(t=6.234，6.658，P<0.05);Cyclin E protein content,(A0-A24)/A0 of the treatment group were lower than those of the control group(t=17.586，26.679，P<0.01); VEGFA,VEGFB,VEGFC content in cell media of the treatment group were lower than those of the control group(t=15.237，13.894，16.382，all P<0.01).ConclusionPin1 inhibitor Juglone can effectively inhibit proliferation,migration and angiogenic ability of breast cancer cell line MCF7Adr;Pin1 inhibitors can be used as an alternative drug therapy for breast cancer.

Key words:Breast cancer; Pin1 inhibitor; Cell cycle; Angiogenesis

收稿日期：2014-08-18修回日期:2014-12-30編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.13.055

中圖分類號：R730

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)13-2445-03