脂多糖通過TLR4-Src信號介導微囊胞吞血管內皮鈣黏蛋白和增加血管通透性*

張 曄 張連陽 譚 浩 李 陽 孫士錦

脂多糖通過TLR4-Src信號介導微囊胞吞血管內皮鈣黏蛋白和增加血管通透性*

張 曄 張連陽#譚 浩 李 陽 孫士錦

目的：探討脂多糖(LPS)誘導微囊胞吞血管內皮鈣黏蛋白(VE-Cad)的可能機制。方法：培養人血管內皮細胞株CRL-2922，當其生長至融合狀態時分為正常對照組(不予再處理)、LPS處理組(采用10μg/ml LPS分別與CRL-2922再培養1h、2h、4h和6h)、LPS+抑制劑組包括Toll樣受體4(TLR4)抑制劑CLI-095和Src抑制劑SU6566[在LPS培養細胞時分別加入CLI-095(5μg/ml)和SU6566(2μmol/L)再培養4h]。采用Western Blotting法檢測各組Src蛋白表達、Cav1磷酸化和VE-Cad質膜蛋白表達，以及Cav1與VE-Cad共沉淀水平；采用培養小室半透膜培養細胞，并檢測相關各組細胞熒光透過率，以反映血管通透性。結果：LPS處理不同時間組Src蛋白表達均較正常對照組升高(P<0.05)；與正常對照組比較，LPS處理4h組Cav1磷酸化增強(P<0.05)、VE-Cad質膜蛋白表達下調、Cav1與VE-Cad共沉淀水平升高(P<0.05)，單層細胞熒光透光率增加(P<0.05)；TLR4抑制劑和Src抑制劑可顯著降低LPS增高的Src蛋白高表達和Cav1高度磷酸化(P<0.05)，上調VE-Cad質膜蛋白表達(P<0.05)，下調Cav1與VE-Cad共沉淀水平(P<0.05)，改善單層內皮細胞通透性(P<0.05)。結論：LPS可能通過TLR4-Src信號途徑誘導微囊胞吞VE-Cad和增加血管通透性。

脂多糖；Toll樣受體4；Src蛋白；微囊胞吞血管內皮鈣黏蛋白；血管通透性

嚴重創傷、膿毒癥患者存在血管通透性增高，脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)是膿毒癥的重要啟動因子，闡明LPS誘導血管通透性增高的發生機制有重要意義。本實驗室前期研究(待發表)發現，細胞質膜微囊(Caveolae，簡稱微囊)介導血管內皮鈣黏蛋白(Vascular Endothelial Cadherin，VE-Cad)胞吞是LPS致血管通透性增高的重要原因；同時發現，微囊胞吞VE-Cad過程中，微囊重要結構蛋白小窩蛋白(Caveolin-1，Cav1)磷酸化顯著增高。但LPS磷酸化Cav1的信號途徑目前尚不清楚。

研究表明，人肺微血管內皮細胞原癌基因c-Src活化可加強Cav1磷酸化和微囊胞吞白蛋白和霍亂毒素B亞基[1]，而LPS可活化Src[2]，且與Toll樣受體4(Toll-like Receptor 4，TLR4)有關[3]。因此推測，LPS可能通過TLR4和Src途徑磷酸化Cav1，進而調節微囊胞吞行為，增加內皮細胞和血管通透性。本實驗采用LPS處理人血管內皮細胞株CRL-2922，通過免疫印跡法檢測其Src蛋白表達、Cav1磷酸化、VE-Cad質膜表達，以及Cav1與VE-Cad共沉淀水平，同時采用生物半透膜檢測單層內皮細胞的熒光透過率，探討TLR4-Src途徑是否參與LPS誘導微囊胞吞VE-Cad和增加血管通透性。

1 材料與方法

1.1 實驗用細胞、試劑和儀器

人血管內皮細胞株CRL-2922購自ATCC (American Type Culture Collection)。VE-Cad抗體(批號：sc-6458)、Cav1抗體(批號：sc-894)和c-Src抗體(批號：sc-18)均購自美國Santa Cruz公司；Cav1 Tyr14位點磷酸化抗體(批號3251)購自美國Cell Signaling公司，異硫氰酸熒光素標記牛血清白蛋白(FITC-BSA)、LPS(批號L2880)和β-actin(批號A5441)均購自美國Sigma公司；質膜蛋白提取試劑盒(批號：ab65400)購自美國Abcam公司；Src抑制劑SU6656(批號：572636)購自美國Merck公司，TLR4抑制劑CLI-095(批號：243984-11-4)購自美國Invivogen公司；DMEM-高糖培養基購自美國HyClone公司，胎牛血清購自美國Gibco公司。培養小室(型號3452)購自美國Corning公司，

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及分組處理：將CRL-2922細胞株加入含15%胎牛血清、4mmol/L L-谷氨酰胺、4 500mg/L葡萄糖、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM培養基中，分別用25ml培養瓶和培養小室半透膜培養。當細胞生長至融合狀態時，隨機分為正常對照組、LPS處理組(包括1h、2h、4h、6h亞組)和LPS+抑制劑組(包括TLR4抑制劑CLI-095和Src抑制劑SU6566)，各組n均=4。正常對照組不予再處理；LPS處理組采用LPS(10μg/ml)與培養細胞再培養不同時間；LPS+抑制劑組即在LPS培養細胞時分別加入CLI-095(5μg/ml)和SU6566(2μmol/L)共同培養4h。收集各組細胞，按常規方法提取細胞總蛋白，采用Western Blotting檢測各組Src蛋白表達、Cav1磷酸化、VE-Cad質膜表達，以及Cav1與VE-Cad共沉淀水平，同時檢測各組內皮細胞熒光透過率(血管通透性)。

1.2.2 Src蛋白、Cav1磷酸化、VE-Cad質膜表達以及Cav1與VE-Cad共沉淀水平檢測：(1)Src蛋白、Cav1磷酸化和VE-Cad質膜表達的檢測：均參照常規Western Blotting，采用8% SDS-PAGE凝膠電泳，Src抗體滴度1∶1 000，Cav1磷酸化抗體滴度1∶1 000，VE-Cad抗體滴度1∶200，β-actin抗體滴度均為1∶2 000。Quantity One軟件分析蛋白電泳條帶，以Src蛋白、Cav1磷酸化、VE-Cad與β-actin光密度比值分別表示上述蛋白表達水平。(2)Cav1和VE-Cad免疫共沉淀：在細胞裂解液中分別加入VE-Cad抗體(1∶50)和蛋白G-瓊脂糖，4℃過夜，洗滌沉淀并煮沸分離后，常規Western Blotting檢測Cav1(1∶200稀釋)表達，洗膜后檢測VE-Cad質膜表達。以Cav1/VE-Cad電泳條帶光密度值之比表示兩者共沉淀水平。

1.2.3 內皮細胞通透性檢測：通過單層內皮細胞熒光透過率表示細胞通透性。取細胞融合生長的培養小室，在其上腔液中加入FITC-BSA作為示蹤劑，在下腔液中取樣，每隔15min一次，累計2h，檢測下腔液樣品的熒光強度，用累計熒光透過率表示細胞通透性[4]。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 Src蛋白表達

正常對照組Src蛋白低表達(0.125±0.023)；LPS處理組Src蛋白表達均比正常對照組增高(F=5.76，P<0.05)。TLR4抑制劑組Src蛋白表達顯著低于LPS處理4h組(P<0.05)。見圖1。

注：與正常對照組比較,*P<0.05;與LPS處理4h組比較,#P<0.05圖1 LPS處理不同時間Src蛋白表達及TLR4對其的抑制

2.2 Cav1磷酸化和VE-Cad質膜表達及其兩者共沉淀水平

各組間Cav1磷酸化、VE-Cad質膜表達及Cav1與VE-Cad共沉淀水平比較均有統計學差異(F分別為6.21、8.53、5.79，P均<0.05)。正常對照組Cav1磷酸化為0.038±0.021，VE-Cad質膜表達水平為0.608±0.085，Cav1與VE-Cad共沉淀水平為0.000±0.000。LPS處理4h組Cav1磷酸化水平較正常對照組顯著增高(P<0.05)，VE-Cad質膜表達較正常對照組顯著降低(P<0.05)。與LPS處理4h組比較，Src抑制劑組和TLR4抑制劑組Cav1磷酸化水平均明顯降低(P<0.05)，VE-Cad質膜表達均明顯增加(P<0.05)，Cav1和VE-Cad共沉淀水平也明顯降低(P<0.05)。見圖2。

注：與正常對照組比較,*P<0.05;與LPS處理4h組比較,#P<0.05圖2 各組Cav1磷酸化、VE-Cad質膜表達和兩者共沉淀水平

2.3 單層內皮細胞通透性

各組間單層內皮細胞熒光透過率比較，差異有統計學意義(F=10.26，P<0.05)。與正常對照組內皮細胞熒光透過率(0.263±0.041)比較，LPS處理4h組顯著增高(P<0.05)； 與LPS處理4h組比較，Src抑制劑組和TLR4抑制劑組均明顯降低(P<0.05)。見圖3。

注：與正常對照組比較,*P<0.05;與LPS處理4h組比較,#P<0.05圖3 各組單層內皮細胞熒光透過率

3 討 論

本實驗室前期研究發現，微囊胞吞VE-Cad是LPS致血管通透性增高的重要原因，但目前尚無文獻報道LPS通過何種信號途徑促使內皮細胞微囊胞吞VE-Cad。根據基礎研究，微囊的胞吞功能與Cav1磷酸化有關，而Src可促進Cav1磷酸化。在肺微血管內皮細胞，激活Src可導致Cav1的Tyr14位點磷酸化，促進微囊對白蛋白的胞吞，Src抑制劑PP2可以抑制Cav1的磷酸化和微囊的胞吞作用，利用基因技術使Cav1的磷酸化位點突變，也可阻斷c-Src激活引起的微囊對白蛋白和霍亂毒素B的胞吞作用[1,5]。LPS作用后的血管內皮細胞，Src的表達和活性是增高的。在肺血管內皮細胞，LPS可通過結合TLR4激活Src[3]；在大鼠尾動脈內皮細胞，LPS(100ng/ml)作用8h可導致Src活化[2]。提示LPS可以通過TLR4活化Src和磷酸化Cav1，使內皮細胞微囊的胞吞功能增強。

本研究發現，LPS處理后的人血管內皮細胞，其Src蛋白表達隨LPS處理時間延長而增加，Cav1磷酸化水平較正常對照組升高，VE-Cad質膜表達較正常對照組降低；采用TLR4抑制劑和Src抑制劑干預后上述增加的Src蛋白和Cav1磷酸化顯著降低，降低的VE-Cad質膜表達則顯著上調；而且，LPS處理還能增加單層內皮細胞通透性，TLR4和Src抑制劑能使增加的通透性明顯降低。該結果與上述理論和實驗基本一致，表明TLR4-Src信號途徑可能參與誘導微囊胞吞VE-Cad和增加血管通透性。

本實驗只對LPS處理后Src總的蛋白表達進行了觀察，未對Src磷酸化程度進行檢測，對Src生物活性的評價不夠充分。另外，由于實驗條件限制，只采用化學藥物對可能的信號途徑進行了阻斷，未采用基因敲除方法進一步驗證。后續實驗將充實上述內容，并采用免疫熒光方法檢測LPS處理后Cav1與VE-Cad的共沉淀水平，進一步分析微囊對VE-Cad的胞吞作用。

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本文第一作者簡介：

張 曄(1979-),男，漢族，碩士，主治醫師，主要從事創傷后臟器功能損傷機制研究

1 Sounni NE, Paye A, Host L, et al. MT-MMPS as Regulators of vessel stability associated with angiogenesis[J]. Front Pharmacol，2011, 2: 111.

2 Kox M, Wijetunge S, Pickkers P, et al. Inhibition of Src family tyrosine kinases prevents lipopolysaccharide-induced hyporeactivity in isolated rat tail arteries[J]. Vascul Pharmacol，2007, 46(3): 195-200.

3 Gong P, Angelini DJ, Yang S, et al. TLR4 signaling is coupled to SRC family kinase activation, tyrosine phosphorylation of zonula adherens proteins, and opening of the paracellular pathway in human lung microvascular endothelia[J]. J Biol Chem，2008, 283(19): 13 437-13 449.

4 Zhao D, Qin L, Bourbon PM, et al. Orphan nuclear transcription factor TR3/Nur77 regulates microvessel permeability by targeting endothelial nitric oxide synthase and destabilizing endothelial junctions[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2011, 108(29): 12 066-12 071.

5 Sverdlov M, Shinin V, Place AT, et al. Filamin A regulates caveolae internalization and trafficking in endothelial cells[J]. Mol Biol Cell，2009, 20(21):4 531-4 540.

Contribution of TLR4-Src Signal Pathway to Caveolae-mediated Endocytosis of VE-Cad after LPS Treatment

ZHANG Ye, ZHANG Lian-yang#, TAN Hao, LI Yang, SUN Shi-jin

State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, Trauma Center of PLA, Institute of Surgery Research, Daping Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400042, China;#

Objective: To observe the mechanism of caveolae-mediated endocytosis of VE-Cad after LPS treatment.Method: Human vascular endothelial cell line CRL-2922 was cultured. It was divided into normal control group (when it grew to confluence state), LPS-treated group (using 10μg/ml LPS to incubate with the CRL-2922 for 1h, 2h, 4h and 6h); and LPS+inhibitor group[adding CLI-095 (5μg/ml) and SU6566 (2μmol/L) in the LPS cultured cells and then culturing for 4h]. Western Blotting was used to detect the Src protein expression, Cav1 phosphorylation, plasma membrane protein expression of VE-Cad, phosphorylation of Cav1 and co-precipitation levels of Cav1 and VE-Cad; semi-permeable membrane was used to culture cells, and the relevant cells fluorescence transmittance was detected to reflect vascular permeability.Results: The protein expression of Src was gradually increased after LPS treatment, as well as the phosphorylation (Tyr14) of Cav1 and he monolayer cell permeability (P<0.05), and the membrane expression of VE-Cad decreased (P<0.05). The increased expression and phosphorylation could be decreased by the inhibitor of TLR4 CLI-095 and the inhibitor of Src SU6656 (P<0.05), and the inhibitors could increase the membrane expression of VE-Cad (P<0.05), and improve the monolayer cell permeability at 4h after LPS treatment (P<0.05).Conclusion: Caveolae-mediated endocytosis of VE-Cad was activated through LPS-TLR4-Src signal pathway.

Lipopolysaccharide; Toll-like receptor 4; Src; Caveolae-mediated endocytosis of VE-Cadherin； Vascular permeability

“十二五”國家科技支撐計劃(2012BAI11B01);軍隊“十二五”重點項目(BWS12J033)

第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所創傷中心，創傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室, 重慶400042;#

，電話：023-68757991，E-mail：hpzhangly@163.com

本文2014-12-15收到，2015-02-28修回

R605.971

A

1005-1740(2015)02-0001-04