痰瘀互結型動脈粥樣硬化大鼠視網膜和腸系膜微循環觀察*

張方申 彭 欣 秦 林 張海燕 閆 濱 武 雙

痰瘀互結型動脈粥樣硬化大鼠視網膜和腸系膜微循環觀察*

張方申1彭 欣2，#秦 林2張海燕2閆 濱2武 雙2

目的：觀察痰瘀互結型動脈粥樣硬化(AS)大鼠視網膜和腸系膜微循環的變化。方法：雄性6周齡Wistar大鼠40只，其中20只采用維生素D3(VD3)大劑量腹腔注射聯合高脂乳劑長期灌胃的方法，建立痰瘀互結型AS大鼠模型(AS組)，其余20只平行腹腔注射生理水以及純凈水灌胃作為對照組。對兩組大鼠進行視多膜熒光造影，觀察視網膜微血管形態及伴行動、靜脈管徑比值(DA/DV)。采用微循環觀測系統分析兩組大鼠腸系膜微血管形態、血流速度和DA/DV。結果：VD3大劑量腹腔注射聯合高脂乳劑長期灌胃可成功建立痰瘀互結型AS大鼠模型，與對照組比較，AS組大鼠體重增加(t=5.99,P<0.05),總膽固醇水平升高(t=-13.94,P<0.05)，動脈硬化指數(AI)≥4.0。AS組大鼠視網膜及腸系膜微血管數量減少、形態異常，血供不足，血液流速較對照組明顯減慢(P<0.05)、微動脈變細、DA/DV明顯小于對照組(P均<0.05)；并可見視網膜微血管瘤及血液滲出。結論：觀察痰瘀互結型AS大鼠視網膜及腸系膜微循環變化，可為臨床診療和新藥研發提供實驗依據。

痰瘀互結；動脈粥樣硬化；微循環；大鼠

動脈粥樣硬化(AS)患者多表現為體胖多痰、肢體麻木疼痛、苔白膩、脈沉滑或澀、舌暗紫。既有“津液結聚”的痰濁病征，又有“血行緩滯”的血瘀表現。其中醫證型為典型的痰瘀互結證[1]。隨著國民生活水平的提高，煙酒和肉類飲食的增加，痰瘀互結型AS比例日見增加[2]。

上世紀60年代有臨床學者提出，AS患者眼底微循環與心腦血管微循環病變密切相關[3]。晚近臨床也發現，AS患者腸系膜磁共振圖像也呈現出相應的病理變化[4]。但在基礎研究中，AS動物模型的微循環研究尚顯不足，痰瘀互結型AS大鼠模型的微循環相關報道更為匱乏?；贏S可能引起全身微循環改變的認識[5],本文對正常大鼠及痰瘀互結型AS大鼠進行了多部位微循環觀察比較，為臨床診療和新藥研發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

健康雄性6周齡Wistar大鼠40只,體重190±10g，購自山東魯抗醫藥股份有限公司實驗動物中心，許可證號：SCXK(魯)20130001。按隨機數字表法將大鼠分為正常對照組(對照組)和痰瘀互結型AS模型組(AS組)，每組20只。兩組大鼠均籠養，普通飼料，潔凈飲水。實驗室溫度21℃-24℃ ，相對濕度55%-75%，光照10h。適應性喂養1周后進行實驗。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器：手持式視網膜照相機，日本興和株式會社生產，型號Genesia-D；共聚焦激光造影系統，德國海德堡公司生產，型號HRA；微循環顯微鏡和醫學圖像分析系統，成都泰盟科技有限公司生產，型號BI-2000；電子分析天平，上海精科天平公司生產，型號FA 1004；Image-Pro Plus 5.0.2圖像處理分析軟件，美國Media Cybernetics出品。水浴溫鍋、磁力攪拌器、GB303電子天平均由濟南長征醫療器械公司提供。

1.2.2 試劑：總膽固醇(TC)測試盒、高密度脂蛋白(HDL)測試盒，北化康泰臨床試劑有限公司生產，批號分別為006340和006328；鹽酸環噴托酚滴眼液，s.a.ALCON-COUVREURn.v.生產，批號H20070213；熒光素鈉注射液，廣州白云山明興制藥有限公司生產，批號140201；維生素D3，阿拉丁試劑有限公司生產，批號A1413005；水合氯醛，天津市科密歐化學試劑有限公司生產，批號20130325。高脂乳劑自行配制，所需試劑及方法：豬油20g放入200ml燒杯中，磁力攪拌器加熱溶化。當溫度升到100℃時加入5g 膽固醇，溶化后再加入1g丙硫氧嘧啶,充分攪勻，然后加入20ml吐溫-80制成油相。同時，在另一燒杯中加入蒸餾水30ml和丙二醇20ml，電爐上加熱至60℃時加入1g膽酸鈉、1g谷氨酸鈉,充分攪拌直到完全溶解,制成水相。最后將水相加入油相中充分攪拌混勻，制成高脂乳劑。配制高脂乳劑所需試劑均購自山東永恩試劑耗材有限公司。

1.3 痰瘀互結型AS模型制備[6]和對照組大鼠處理

(1)AS組大鼠按70萬IU/kg體重的總劑量腹腔注射VD3，連續三天，1次/天，第一、二天20萬IU/kg, 第三天30萬IU/kg；對照組大鼠腹腔注射相同體積生理鹽水。

(2)VD3注射完成次日，AS組大鼠采用高脂乳劑灌胃(10ml/kg)，1次/天，連續60天，每10天稱取一次體重。對照組給予相同體積的純凈水灌胃。

(3)灌胃第60天，所有大鼠禁食12h，斷尾取血1ml，枸櫞酸鈉抗凝，離心后取血漿。酶法測定TC、選擇性沉淀法測定HDL，根據公式(TC-HDL)/HDL計算動脈硬化指數(AI)。將AI≥4.0并且爪、唇、舌體暗紫，舌下脈絡紫脹，苔膩或黃或白滑，流涎者確定為痰瘀互結型AS成模大鼠[7]。AS組成模16只(4只未成模大鼠從組中剔除)，對照組無成模大鼠。

1.4 微循環觀察

1.4.1 視網膜微循環觀測：末次灌胃0.5h后，為方便手持視網膜照相機起見，一律選擇大鼠右眼觀察。腹腔注射5%水合氯醛(3ml/kg)。3min后將鹽酸環噴托酚滴眼液1滴滴入大鼠右眼中。2min后用手持式視網膜照相機于暗室中觀察大鼠視網膜微循環并拍攝照片，相機曝光強度設定為0.8-0.9，亮度設定為低檔。每只大鼠于拍照后10min腹腔注射 10%熒光素鈉注射液(0.8ml/kg)，同時用共聚焦

激光造影系統對大鼠視網膜血管進行造影并拍攝照片。對照片中視網膜血管形態進行分析，并通過Image-Pro Plus 5.0.2圖像處理軟件測量由視盤輻射出的伴行動、靜脈管徑比值(DA/DV)。

1.4.2 腸系膜微循環觀測：大鼠眼底微循環觀測后禁食12h。之后腹腔注射5%水合氯醛(5ml/kg)后，于右下腹側壁開約2cm切口,沿盲腸端輕緩牽出一段小腸袢,將腸系膜平鋪于37℃的恒溫觀察槽上。采用微循環顯微鏡(×16)和BI-2000醫學圖象分析系統觀察并攝錄近盲腸端的左結腸動脈到中結腸動脈之間的腸系膜微血管和血管網微循環血流狀態[8]。15min內完成檢測。觀察指標包括：(1)腸系膜微血管形態：觀察微血管數量、血液充盈情況和出血點以及血液流態(線流、線粒流、粒流、擺流)。(2)微血流速度測定：取直徑10μm左右的前細動脈及與之伴行的靜脈，通過BI-2000醫學圖像分析系統測定微動脈流速(BFVA)和微靜脈流速(BFVV)，每只大鼠選取兩對微動、靜脈,測量3次取均值。(3)微血管管徑測量: 采用BI-2000醫學圖像分析系統對上述微動脈、微靜脈管徑(DA、DV)進行測定,每對微動、靜脈測量3次取平均值,并計算DA/DV[9，10]。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 成模大鼠特征

(1)AS組20只大鼠中有16只飲食量、活動量減少；毛色無光，雙目無神，眼瞼變窄甚至出現閉目現象；爪、唇、舌體顏色暗紫，部分舌體出現紫斑，舌下脈絡紫脹，舌苔厚膩，并有間歇性大便溏薄，噴嚏、流涎。末次體重(545.18±20.74g)高于對照組(491.00±21.14g)，差異有統計學意義(t=5.99，P<0.05)，符合痰瘀互結證的體態特征。

(2)16只成模大鼠血漿TC含量明顯升高，AI≥4.0，均與對照組有明顯差異(t=-13.94、-6.54，P均<0.05)，符合痰瘀互結證血脂指標的成模標準，見表1。

2.2 兩組大鼠視網膜微循環

2.2.1 微循環形態：結果顯示，對照組大鼠眼底呈均勻鮮紅色，血供充足，毛細血管豐富；視盤位于眼球后部中央，沿視盤成輻條狀發出6-8支細且直的動脈，并伴行6-8支略粗的靜脈；動、靜脈血管均無明顯迂曲，且粗細均勻(圖1A)。注射造影劑后眼底血管顯影迅速，動、靜脈均在10s內完全充盈，無熒光滲漏(圖1B)。

表1 兩組大鼠TC、HDL、AI 比較

注:與對照組比較,1)P<0.05

AS組大鼠眼底顏色呈淡紅色或粉紅色，血供明顯不足，毛細血管明顯減少；視盤周圍發出的動、靜脈形態不規則、迂曲變形嚴重，粗細不均勻，并有部分輻射狀動、靜脈難以辨認或消失(圖1C)。眼底血管注射造影劑后顯影緩慢(3只大鼠1min時尚未完全顯影)，部分可見血管瘤或熒光滲漏(圖1D)。

2.2.2 DA/DV：與對照組相比，AS組微動脈變細，微靜脈血管較平直。統計結果顯示，AS組DA/DV較對照組明顯減小，差異有統計學意義(t=4.85，P<0.05)。見表2。

表2 兩組大鼠視網膜

注:與對照組比較,1)P<0.05

2.3 兩組大鼠腸系膜微循環

2.3.1 微血管形態：對照組大鼠腸系膜微血管數量正常，充盈良好，未見出血點；血管壁平滑完整，粗細均勻；血色深紅；管袢血流以線粒流為主，部分為粒流，未見擺流(圖2A)。AS組大鼠腸系膜微血管數量明顯減少，較多微血管充盈不良，甚至管袢消失；血管壁平滑度較差或管壁增厚；可見陳舊性出血斑；血色暗紅；管袢血流以粒線流為主，且有較多擺流或聚集流(圖2B)。

2.3.2 微血流速度：AS組大鼠微血流速度明顯減慢，BFVA和BFVV均低于對照組，差異有統計學意義(t=6.45、6.76，P均<0.05)，見表3。

2.3.3 微血管管徑：與對照相比，AS組DA明顯縮窄而DV變化不明顯，致DA/DV減小，差異有統計學意義(t=2.42,、2.54，P均<0.05)，見表4。

表3 各組大鼠腸系膜微血管

注:與對照組比較,1)P<0.05

表4 各組大鼠腸系膜微血管DA、DV及

注:與對照組比較,1)P<0.05

[本文圖1、圖2見封3]

3 討 論

AS的中醫證型按發病頻次依次為痰瘀互結型、肝腎陰虛型、氣虛血瘀型、脾虛濕盛型，其中痰瘀互結型占32.63%[11]。研究認為該證型由過食肥甘厚膩而致脾虛而生痰、痰阻血脈而生瘀，使津液結聚、血行緩滯，痰瘀互結侵及脈道引起。本實驗采用高脂乳劑長期灌胃大鼠，致其痰濕血瘀；通過注射VD3促進血管鈣化，協同損傷血管內皮[12]，成功建立痰瘀互結型AS模型。

廣義微循環是指直接參與組織、細胞的物質、信息、能量傳遞的血液、淋巴液、組織液的流動[13]；但狹義微循環專指微動脈、微靜脈與組織之間微血管中的血液循環，其重點在微血管的分布、結構、功能及其中血液的流態、流速和理化性質[14]。本文選擇觀察痰瘀互結型AS大鼠狹義微循環的相關變化。

視網膜微血管分布與腦微血管分布相似，其微循環變化可在一定程度上反映腦微循環，成為在體微循環檢查的重要窗口之一[15]。臨床研究多在眼部病患或與之相關病變時進行視網膜微循環檢查。既往已經開展了的視網膜微循環相關研究的動物實驗多為離體觀察，如黃曉燕等[16,17]利用消化鋪片法分別對高血壓大鼠、糖尿病大鼠視網膜進行了相關分析。其局限性在于只是觀察視網膜微血管的變化，而無法觀察其中的血液循環情況。最近馬棟[18]采用眼底血管熒光造影的方法觀察了糖尿病動物視網膜微血管損傷，更能說明眼底微循環病理變化。本實驗采用視網膜血管造影聯合視網膜攝錄技術對痰瘀互結型AS視網膜微循環進行了研究。

臨床上針對腸系膜的相關檢查一般采用CT、磁共振、超聲等設備[4,19,20]。在動物實驗中，由于設備原因，且可接受有創檢查，故多將腸系膜置于倒置顯微鏡下直接觀察其微循環[9,10]。本實驗亦是利用該種方法對痰瘀互結型AS腸系膜微循環進行了研究。

本實驗研究發現，痰瘀互結型AS同時存在著視網膜及腸系膜微循環的病理變化，包括血液流速減慢、微血管數量減少、微動脈變細和血液滲出。該病理變化過程大致如下：大劑量VD3腹腔注射加上長期高脂灌胃導致大鼠微血管鈣化、脂代謝異常，引起血脂升高；高血脂導致動脈粥樣硬化加速，并使血漿黏度增高和血小板聚集，從而使血流阻力增大、血液流速減慢、微血管充盈度下降和痙攣；微血管持續性痙攣可引起微動脈內膜深層的脂肪變性和微血管缺血缺氧，導致微動脈管徑狹窄或閉塞、血管內皮損傷；血管內皮損傷使微血管通透性增加，導致血液滲出。

痰瘀互結型AS大鼠外周微血管存在微循環障礙，并增加出血風險。微循環觀察的動物實驗可為臨床診療和新藥研發提供依據。

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本文第一作者簡介：

張方申(1989-)，男，漢族，碩士研究生，主要從事生物醫學工程技術與現代中醫方藥研究

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Microcirculation of the Retina and Mesenteric in Atherosclerosis Rats with Syndrome of Intermin-gled Phlegm and Blood Stasis

ZHANG Fang-shen1,PENG Xin2, #,QIN Lin2,ZHANG Hai-yan2,YAN Bin2,WU Shuang2

1Institute of Technology, Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250300,China;2Institute of Basic Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;#

Objective: To observe the retina and mesenteric microcirculation change of atherosclerosis (AS) rats with syndrome of intermin-gled phlegm and blood stasis.Method: There were 40 male Wistar rats,20 of which used the method of VD3 large-dose intraperitoneal injection combined with long-term high-fat emulsion gavage , establishing the model of AS rats with syndrome of intermin-gled phlegm and blood stasis. The rest 20 of them as control group made parallel intraperitoneal injection with physiological water and pure water gavage.Contrasted success model group (AS group,n=16)with control group and analysed retina and mesenteric microcirculation.Compared these two groups in retinal vascular morphology, arteriovenous diameter DO value(DA/DV),mesenteric microvessels,blood flow velocity, and the difference between DA and DV.Results: Intraperitoneal injection of large doses VD3 combined with fat emulsion long-term gavage method successfully builded the model of AS rats with syndrome of intermin-gled phlegm and blood stasis. Compared with control group,AS rats gained weight(t=5.99,P<0.05),total cholesterol levels elevated(t=-13.94,P<0.05),atherosclerosis index(AI) was≥4.0 and retina and mesenteric microcirculation insufficiency appeared, the blood flow velocity slowed down,the number of microvessels reduced,DA/DV significantly reduced (P<0.05) and arterioles became thinner and had blood oozing. Conclusion:The retina and mesenteric microcirculation change of the AS model rats with syndrome of intermin-gled phlegm and blood stasis can provide experimental foundation for clinical diagnosis and drug discovery.

Syndrome of intermin-gled phlegm and blood stasis;Atherosclerosis;Microcirculation;Rats

山東省自然科學基金資助項目(ZR2013HM053)；山東省教育廳科技計劃基金資助項目(J06L19)

1山東中醫藥大學理工學院，濟南，250300；2山東中醫藥大學基礎醫學院，濟南，250355；#

，E-mail: qinlin0531@163.com

本文2014-11-25收到，2015-01-04修回

R331.3+5 R255.9

A

1005-1740(2015)01-0010-05