促甲狀腺激素受體可在微血管內皮細胞表達*

楊光燃 楊芳遠 曹 曦 楊金奎

促甲狀腺激素受體可在微血管內皮細胞表達*

楊光燃 楊芳遠 曹 曦 楊金奎

目的：檢測促甲狀腺激素受體(TSHR)在小鼠腦微血管內皮細胞(bEnd.3)的表達。方法：取對數生長期bEnd.3細胞，采用RT-PCR和Western Boltting方法檢測bEnd.3細胞TSHR mRNA和蛋白表達水平。結果：bEnd.3 細胞總RNA濃度為2.9186μg/μl，A260/A280為1.97。TSHR mRNA的擴增效率為96.41%±0.82%，溶解曲線呈單峰，相對表達量為0.64±0.14(相對睪丸組織)。電泳結果顯示bEnd.3 細胞能清晰表達TSHR mRNA。Western Blotting顯示bEnd.3細胞可以檢測到TSHR的α和β亞基蛋白表達，β亞基相對表達量為0.46±0.05(相對β-actin)。結論：小鼠腦微血管內皮細胞可表達TSHR，該結果有助于臨床研究TSH對血管內皮細胞功能的影響。

促甲狀腺激素受體； 微血管； 內皮細胞

促甲狀腺激素(Thyroid Stimulating Hormone, TSH)是由垂體促甲狀腺細胞合成的一種異三聚體糖蛋白，主要靶器官為甲狀腺，通過與甲狀腺細胞表面TSH受體 (Thyroid Stimulating Hormone Receptor, TSHR) 結合來調節甲狀腺細胞的生長、增殖和分化。有研究者通過RT-PCR等技術證實，TSHR除了存在于甲狀腺濾泡細胞膜外，尚存在于多種甲狀腺外組織細胞，如大腦組織、眼外肌、腎臟、睪丸等[1-5]。但是腦微血管內皮細胞上是否有TSHR表達鮮有研究報道。本文檢測小鼠腦微血管內皮細胞(bEnd.3)TSHR mRNA和蛋白表達水平，為TSH與腦微血管關系的機制研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑與儀器

bEnd.3細胞購自美國ATCC公司。睪丸組織取自成年C56BL/6小鼠(n=3)。DMEM培養基(批號11995-065)、超純RNA提取試劑盒(批號CW0581)、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒(批號CW0744)、SYBR PCR 預混體系(批號 CW0956)、DNase 1(批號CW2090)、BCA蛋白定量試劑盒(批號02912E)均為美國CWbio公司產品；蛋白酶抑制劑(批號04693116001，美國Roche公司)；TSHR抗體(批號SC-13936，美國Santa Cruz公司)；β-actin(批號TA-09，中杉金橋公司)；RIPA蛋白抽提試劑(批號R00010，北京索萊寶公司)。PCR儀(Linegen型，杭州博日公司)；電泳儀(HT-Sub02型，北京鴻濤基業)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養：采用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養bEnd.3細胞至對數生長期，接種于10ml培養瓶中(n=3)，置于37℃、5% CO2細胞恒溫孵育箱內培養，待細胞覆蓋瓶底約80%后吸出培養液，用1M PBS漂洗1次，0.05%胰酶-EDTA消化液消化細胞，離心后再用1M PBS漂洗1次。所得細胞用于TSH mRNA和蛋白水平的檢測。

1.2.2 PCR引物設計： TSHR和內參GAPDH基因引物根據標準RT-PCR引物原則設計，TSHR引物序列參照文獻[6]，由Invitrogen公司合成。見表1。

表1 TSHR引物和內參引物

1.2.3 RT-PCR檢測TSH mRNA相對表達量：按照RNA提取試劑盒說明書提取RNA。bEnd.3 細胞總RNA濃度為2.9186μg/μl，A260/A280為1.97，純度較高。按照HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒說明書，反應體系為：引物 2μl、RNA 模板 2μl、加RNase-Free water至15μl，65℃孵育5min，迅速冰浴，短暫離心(12 000rpm,4℃)。繼續向以上反應液中加入以下試劑：5×RT混合液 4μl、HiFi-MMLV酶混合液 1μl，混勻，37℃孵育40min。反應結束后70℃保溫10min。SYBR PCR擴增，按說明書進行，反應體系為：SYBR PCR 預混體系(2×) 10μl，上、下游引物(10μM)各1μl，模板 2μl，加入滅菌蒸餾水至20μl。擴增程序為：95℃ 10min， 95℃ 15s后，59℃ 60s，45個循環。每個樣本設2個復孔，采用2-△△ct方法計算bEnd.3 細胞和睪丸組織的mRNA表達量，再將睪丸組織的TSHR mRNA表達量設定為1，計算bEnd.3 細胞的TSHR mRNA相對表達量。

1.2.4 Western Blotting檢測TSHR蛋白表達：待測樣本中加入預冷RIPA蛋白抽提試劑，加入蛋白酶抑制劑進行蛋白抽提，取上清，用BCA法定量測定蛋白濃度。配制10%分離膠，濃縮膠濃度為5%。待測蛋白樣品上樣量30μg/孔。電泳條件：濃縮膠恒壓90V，約20min；分離膠恒壓120V，約90min。濕轉法300mA恒流轉膜100min。封閉：將膜完全浸沒于5%BSA-TBST中，水平搖床孵育1h(RT)。一抗孵育4℃過夜，次日TBST洗膜3次，每次10min。二抗孵育，山羊抗兔IgG(H+L)HRP和山羊抗鼠IgG(H+L)HRP 1∶10 000，室溫孵育 40min。TBST洗膜3次，每次10min。ECL滴加到膜的蛋白面，反應3-5min；膠片曝光顯影。每個樣本設2個復孔，以目標蛋白與β-actin電泳條帶的灰度比值作為該蛋白的相對表達量。

2 結 果

2.1 bEnd.3細胞TSHR mRNA表達量

TSHR mRNA的擴增效率(96.41%±0.82%)較高，溶解曲線呈單峰，特異性強，見圖1。定量分析結果表明bEnd.3細胞TSHR mRNA相對表達量為0.64±0.14。電泳結果顯示，bEnd.3 細胞能清晰表達TSHR mRNA(圖2)。

2.2 bEnd.3細胞TSHR 蛋白表達量

bEnd.3細胞經Western Blotting電泳可以檢測到抗體說明書上標示的TSHR的β亞基(42kd)和 α亞基(62kd)，而睪丸組織只檢測到β亞基(圖3)。電泳條帶灰度分析顯示bEnd.3 細胞TSHR β亞基蛋白相對表達量為0.46±0.05，低于睪丸組織TSHR β亞基蛋白的相對表達量(0.72±0.06)。

圖1 TSHR mRNA擴增(上圖)、溶解(下圖)曲線

圖2 bEnd.3細胞TSHR mRNA電泳圖

圖3 bEnd.3 細胞TSHR蛋白電泳圖

3 討 論

以往研究認為TSHR主要表達于甲狀腺、眼外肌、大腦的某些特定部位[1-3]、腎臟以及睪丸[4-6]。本研究發現TSHR可表達于小鼠腦部微血管內皮細胞。

TSHR在多種組織細胞的表達，可能與其對不同組織細胞的作用有關。近年研究發現亞臨床甲狀腺功能減退癥(Subclinical Hypothyroidism, SCH)患者的血清TSH水平升高而甲狀腺激素正常這種狀態，與血管功能受損[7]、心功能障礙[8]等有關，因此認為，SCH與高血壓、高脂血癥、高血糖等一樣，是缺血性心臟病的獨立危險因素[9]，而且可能增加冠心病事件及冠心病死亡風險[10]。另有研究報道，甲狀腺功能正常人群，其TSH水平升高與冠心病患者頸動脈內膜中層厚度[11]、心力衰竭預后[12]、總膽固醇水平[13]、老年男性代謝綜合征的患病風險[14]均有關。部分原因可能是TSH參與肝臟的膽固醇代謝[15]及甘油三酯代謝[16，17]。

關于微血管內皮細胞上是否有TSHR表達鮮有研究報道。已有的研究證實肝細胞和臍靜脈內皮細胞上可檢測到TSHR表達[16，18]。還有臨床研究將127例合并SCH患者與隨機選擇的甲狀腺功能正常2型糖尿病患者進行比較，結果發現前者有較高的糖尿病視網膜病變患病率，特別是威脅視力的視網膜病變[19]。另一項病例對照研究也證實，增殖型視網膜病變患者有較高的SCH患病率，并且在校正性別、年齡、糖化血紅蛋白等因素后兩者仍呈正相關，而且增殖型視網膜病變合并糖尿病腎病患者在進一步校正尿白蛋白排泄率和血肌酐后，增殖型視網膜病變仍與TSH升高有關[20]。

目前有關TSH水平升高增加微血管病變風險的機制尚不明確。本研究通過RT-PCR和Western Blotting發現小鼠腦微血管內皮細胞可表達TSHR mRNA和蛋白。該結果可能有助于進一步探討TSH對微血管內皮細胞的影響及其作用機制。

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本文第一作者簡介：

楊光燃(1972—)，女，漢族，博士，副主任醫師，研究方向為糖尿病及其并發癥

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Expression of Thyroid Stimulating Hormone Receptor on Microvascular Endothelial Cells

YANG Guang-ran, YANG Fang-yuan, CAO Xi, YANG Jin-kui

Department of Endocrinology, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing 100730, China

Objective:To evaluate the expression of thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) on mouse microvascular endothelial cells (bEnd.3). Method:Real-time PCR and Western-boltting were used to analyze the expression of TSHR mRNA and TSHR protein in the bEnd.3 cells.Results:TSHR mRNA expression was detected in the bEnd.3 cells. The content of RNA in the bEnd.3 cells was 2.9186μg/μl, and its ratio of A260/A280 was 1.97. TSHR was amplified and the amplification efficiency was 96.41%±0.82%. Dissociation curve from real-time PCR was unimodal. The relative quantity of TSHR mRNA in the bEnd.3 cells was 0.64±0.14, when the quantity of TSHR mRNA in the testicle was set as 1.0. TSHR α and β subunit were detected by Western-blotting. The protein ratio of TSHRβ/β-actin was 0.46±0.05 in the gray scale analysis.Conclusion:The expression of TSHR could be found in the bEnd.3 cells. This finding may be helpful to explore the effect of thyroid stimulating hormone on microvascular endothelial cells.

Thyroid stimulating hormone receptor； Microvascular； Endothelial cell

國家自然科學基金項目(81471009)；北京市衛生系統高層次衛生技術人才培養計劃(2014-3-013)；首都醫科大學基礎臨床科研合作課題(14JL46)

首都醫科大學附屬北京同仁醫院內分泌科，北京 100730

本文2015-04-21收到，2015-06-24修回

R581

A

1005-1740(2015)03-0009-04