觀察鏈脲佐菌素誘導的BALB/c糖尿病小鼠睪丸微循環損害*

張曉艷 劉明明 李炳蔚 劉淑英 李宏偉 修瑞娟

觀察鏈脲佐菌素誘導的BALB/c糖尿病小鼠睪丸微循環損害*

張曉艷 劉明明 李炳蔚 劉淑英 李宏偉 修瑞娟#

目的：觀察鏈脲佐菌素(STZ)誘導的BALB/c糖尿病小鼠睪丸微循環變化。方法：20只BALB/c小鼠，采用完全隨機法分為糖尿病組和對照組，每組10只。糖尿病組小鼠連續5天腹腔注射40mg/kg STZ誘導糖尿病模型，對照組注射檸檬酸緩沖液。一周后，應用激光多普勒成像系統(Moor LDLS)檢測兩組小鼠下腹-外陰部皮膚微循環血流灌注水平；分離腹膜，暴露睪丸，應用激光多普勒血流灌注檢測系統(Moor VMS-LDF)檢測兩組小鼠睪丸微循環血流量及睪丸微血管自律運動。心臟灌流后取兩組小鼠睪丸制作組織切片，HE染色觀察睪丸微血管形態，免疫組織化學染色兩步法觀察睪丸微血管內皮細胞抗血小板內皮細胞黏附分子-1(PECAM-1)表達水平。結果：糖尿病組小鼠下腹-外陰部皮膚總血流灌注量低于對照組(P<0.01)；睪丸平均血流灌注水平和微血管自律運動頻率和振幅均顯著低于對照組(P<0.01)；糖尿病組小鼠生精上皮受損，成熟生精細胞減少；睪丸間質微血管增多。睪丸間質微血管內皮細胞PECAM-1表達水平低于對照組(P<0.01)。結論：STZ誘導的BALB/c糖尿病小鼠睪丸微循環存在較多損害。

糖尿病小鼠； 睪丸； 微循環

生育能力降低和不育是男性糖尿病患者常見并發癥之一[1]。近年研究表明，微循環功能可能參與了糖尿病及其并發癥的發病機制[2-4]。睪丸微血管內皮細胞及其維系的睪丸微血管自律運動對睪丸血流灌注至關重要，是睪丸生精功能的結構和功能基礎[5]。目前，糖尿病時睪丸微循環功能異常與睪丸生殖功能損害的關系仍未闡明。本研究通過鏈脲佐菌素(STZ)誘導BALB/c小鼠糖尿病模型，初步觀察其睪丸微循環和組織病理學改變，為糖尿病生殖功能損害機制提供相關依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑和儀器

實驗動物：SPF級雄性BALB/c小鼠20只，體質量20-25g，購自中國醫學科學院實驗動物研究所[SCXK(京)2009-0007]。本研究方案經中國醫學科學院微循環研究所倫理委員會審核批準。

主要試劑及儀器：STZ凍干粉(S0130，Lot No.18883-66-4，美國Sigma公司，使用時用檸檬酸緩沖液配成懸液)。山羊抗小鼠血小板內皮細胞黏附分子-1抗體(PECAM-1，sc-1506，Lot No.G0113，美國Santa Cruz公司)；4%多聚甲醛(P1110，Lot No.20140113，中國索萊寶公司)，Polink-2 Plus山羊超敏兩步法免疫組化檢測試劑盒(PV9003，Lot No.K132415A，中國中杉金橋公司)；檸檬酸(10007118，Lot No.20130704)、檸檬酸三鈉(10019492，Lot No.20130718)均購自中國國藥集團。微量血糖儀及配套血糖試紙(強生穩豪型，Lot No.3623898，美國強生公司)；激光多普勒掃描成像系統(Moor LDLS)和激光多普勒血流灌注監測系統(Moor VMS-LDF)均為英國Moor公司產品。

1.2 動物分組處理

BALB/c小鼠飼養于室溫22-25℃、空氣濕度50%左右、12h明暗交替環境，自由飲水進食。適應性喂養一周后，稱取基線體質量，并測定空腹血糖。采用完全隨機法分為對照組(n=10)和糖尿病組(n=10)。糖尿病組小鼠造模前禁食6h，連續5天腹腔注射STZ(40mg/kg)，一周后，采尾靜脈血檢測其空腹血糖值，大于16.7mmol/L為成模[6]。對照組連續5天腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。

1.3 局部皮膚微循環血流灌注量檢測

采用Moor LDLS檢測兩組小鼠下腹-外陰部皮膚微循環血流灌注水平。1.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠后，將其腹部向上固定于掃描臺，分別應用單幅、連續重復圖像掃描、單線及多通道進行數據采集。掃描分辨率及掃描速度100ms/line，掃描視距12cm。連續重復掃描間隔時間5s，采樣顯示頻率5Hz。掃描寬度64像素，輪廓50像素，單次掃描時間1min，時程3min。設定小鼠下腹-外陰局部皮膚為興趣區域(ROI)，測量其總血流灌注量(PU)。

1.4 睪丸微循環血流灌注水平和微血管自律運動檢測

十字切口切開小鼠近會陰部皮膚，分離腹膜，提拉附著于附睪的白色脂肪以暴露小鼠睪丸。應用Moor VMS-LDF(VP4針式探針)檢測小鼠睪丸微循環血流量及睪丸微血管自律運動。LDF監測基帶帶寬15kHz，血流量輸出5V=1 000Units，時間常數0.5s。單次掃描時間1min，時程3min。通過Moor VMS PC 2.1軟件提取各時相的睪丸血流灌注水平(PU)，計算平均灌注量(PU/min)，通過單位時間內多普勒血流圖波峰或波谷頻數計算睪丸微血管自律運動頻率(cycles/min)，通過單位時間內多普勒血流圖波峰與波谷血流灌注單位差值計算睪丸微血管自律運動振幅(△PU)。

1.5 心臟灌流取材

微循環活體測量完成后行心臟灌流取材。小鼠胸部縱形皮膚切開，于左側肋骨與胸骨交界處開胸，打開心包，暴露心臟；7號鈍頭空心針經左心室插管至主動脈，動脈夾固定鈍頭針。剪開右心耳，注入37℃肝素化生理鹽水(4 000U/L)，起始灌流速度0.015L/min，4min后以0.01L/min再灌5min，至流出液透明無血色為止。分離附睪及脂肪，將睪丸置于4%多聚甲醛固定液中。

1.6 組織切片HE染色

取出固定后睪丸組織進行常規梯度酒精脫水、透明、石蠟包埋，切片(5μm)和HE染色。光鏡下觀察睪丸生精小管及間質微血管形態結構的改變。

1.7 免疫組織化學染色

采用兩步法檢測PECAM-1在睪丸微血管內皮細胞中的表達。采用常規方法對石蠟切片進行脫蠟、水化、蒸餾水沖洗后，用3% H2O2孵育10min去除內源性過氧化物酶，3%牛血清白蛋白室溫封閉30min，按1∶50加入山羊抗小鼠PECAM-1抗體，4℃過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，每次5min；滴加高分子聚合物輔助劑Polymer Helper，室溫孵育20min，PBS清洗3次；滴加辣根過氧化物酶標記的抗山羊二抗(poly-HRP anti goat IgG)，室溫孵育20min，PBS清洗3次；DAB溶液顯色，自來水充分沖洗、蘇木素復染細胞核；蒸餾水浸泡3min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后鏡檢。應用Image J(1.48v)進行PECAM-1表達水平的比較，選擇兩組小鼠睪丸微血管內皮細胞陽性表達區域(棕色)進行積分光密度(IOD)的定量分析。

1.8 統計學處理

2 結 果

2.1 實驗小鼠成模情況

糖尿病組10只小鼠腹腔注射STZ一周后空腹血糖均超過16.7mmol/L(19.80±2.06mmol/L)，并表現出多飲、多尿、多食及體重降低等糖尿病典型臨床表現，全部成模。對照組小鼠血糖水平未見異常(5.62±0.59mmol/L)。

2.2 兩組小鼠下腹-外陰部血流灌注量

與對照組小鼠相比，糖尿病組小鼠下腹-外陰部局部皮膚總血流灌注量明顯降低(2 300.08±327.09PU vs 1 308.34±303.70PU，t=7.027，P<0.01)。

2.3 兩組小鼠睪丸血流灌注水平及睪丸微血管自律運動

對照組小鼠睪丸血流灌注連續穩定，糖尿病組小鼠失去正常節律。與對照組比較，糖尿病組平均血流灌注量顯著降低(466.20±15.00PU/min vs 113.50±18.60PU/min，t=46.670,P<0.01)、睪丸微血管自律運動頻率降低(89.30±3.50cycles/min vs 30.70±3.50cycles/min，t=20.460，P<0.01)、自律運動振幅亦降低(364.50±43.10ΔPU vs 69.10 ± 22.80ΔPU，t=10.500，P<0.01)。見圖1。

2.4 兩組小鼠睪丸組織形態觀察

對照組小鼠生精上皮細胞完整，各級生精細胞有序排列，并可見成熟生精細胞及長形精子，睪丸間質可見微血管分布。糖尿病組小鼠睪丸間質疏松，微血管及間質細胞數量增多；生精小管直徑縮小，曲細精管內生精上皮受損，表現為生精上皮變薄甚至呈空泡樣改變，細胞殘體增多，生精細胞退化， 排列紊亂，成熟生精細胞減少。見圖2。

圖1 兩組小鼠睪丸血流灌注圖

2.5 兩組小鼠睪丸PECAM-1表達水平

對照組小鼠睪丸間質血管內皮細胞PECAM-1連續完整(IOD=106.60±6.90)；糖尿病組小鼠睪丸間質內皮細胞PECAM-1表達缺乏連續性，PECAM-1表達水平(IOD=49.40±6.00)顯著低于對照組小鼠(t=12.525，P<0.01)。見圖3。

[本文圖2、圖3見封2]

3 討 論

隨著糖尿病發病年齡的年輕化，糖尿病對生殖功能的影響逐漸受到關注。有文獻報道糖尿病初期睪丸細胞抗氧化能力顯著下降，能量、物質代謝水平異常[7]；糖尿病患者睪丸細胞功能障礙，可能與持續高血糖導致的氧化應激、活性氧生成增多有關[8-10]；高血糖可破壞Sertoli細胞/血-睪屏障功能，損傷精子質量和生育能力[11]。睪丸微血管內持續而穩定的血流灌注對維持睪丸細胞正常生精功能及內環境穩定起著極為重要的作用[12]。因此，睪丸微循環損害可能參與了糖尿病時睪丸細胞的病理改變。

機體微血管(包括睪丸微血管)自律運動指微血管自主收縮和舒張，其節律沿微血管管壁呈波浪式傳播，從而控制血液呈單向連續流動[13]，調節微循環血流灌注量及其再分布[14]，是評價機體微循環和睪丸微循環功能狀態的重要指標。本研究中糖尿病小鼠睪丸血流灌注水平降低，睪丸微血管自律運動失去正常頻率和振幅可能影響睪丸微循環血液灌注的有效分配，以及血液與組織間激素[15]、營養物質的運輸和代謝產物的交換，是睪丸細胞生殖功能異常的原因之一。

睪丸微血管內皮細胞是睪丸微循環的結構基礎[16]，其結構及功能的完整是保證睪丸微血管內血液穩定灌注的必要條件。高糖毒性可能造成睪丸微血管內皮細胞損傷，間接影響精子的發生。本研究證實糖尿病小鼠睪丸生精細胞形態結構異常，成熟生精細胞減少。為探討原因，筆者檢測了對維持微血管內皮細胞完整性至關重要的PECAM-1。結果表明，糖尿病小鼠睪丸微血管內皮細胞PECAM-1表達顯著減少，并失去連續性，甚至表達缺失。進一步提示糖尿病造成了睪丸微血管內皮細胞損傷以及睪丸生精功能受損。此外，有文獻報道，糖尿病還引起睪丸微動脈管壁增厚，管徑變小，從而加重缺氧誘導的睪丸細胞損傷，影響精子產生，造成男性不育[17, 18]。

綜上所述，糖尿病時睪丸微血管內皮細胞功能損害及睪丸微循環自律運動異常可能是糖尿病導致睪丸生殖功能受損的機制之一。改善睪丸微循環及睪丸微血管自律運動可能是臨床治療男性糖尿病患者生精功能障礙的新靶點。

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本文第一作者簡介：

張曉艷(1967-)，女，漢族，博士，助理研究員，研究方向為睪丸微循環

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Impairment of Testicular Microcirculation in STZ induced BALB/c Diabetic Mice

ZHANG Xiao-yan, LIU Ming-ming, LI Bing-wei, LIU Shu-ying, LI Hong-wei, XIU Rui-juan#

Institute of Microcirculation, Key Laboratory of Microcirculation, Ministry of Health, CAMS & PUMC, Beijing 100005, China;#Corresponding author

Objective:To investigate changes of testicular microcirculation in STZ induced BALB/c diabetic mice. Method:20 BALB/c mice were randomly divided into diabetic group (n=10) and control group (n=10). Diabetic mice were treated with 40 mg/kg STZ for 5 consecutive days while control group was injected with citric acid buffer intraperitoneally. After one week, blood perfusion of lower abdominal - genital skin was evaluated by Moor LDLS, while testicular blood perfusion and microvascular vasomotion were detected by Moor VMS LDF after exposing. Followed cardiac perfusion, the testis of two group mice were prepared. HE staining was used to observe morphological and pathological of testicular micro-vessels, immunohistochemistry staining was employed to determine the expression of PECAM-1. Results:Compared with control group, diabetic mice had decreased lower abdominal - genital skin total blood perfusion (P<0.01), decreased average blood perfusion, frequency and amplitude of vasomotion of testicular micro-vessels (P<0.01, respectively), damaged seminiferous epithelium, decreased matured spermatid, increased interstitial testicular capillaries and discontinuous expression of PECAM-1 (P<0.01). Conclusion:Testicular microcirculation impairs in STZ induced BALB/c diabetic mice.

Diabetic mice; Testis; Microcirculation

中央高校基本科研業務費專項資金資助(33320140193)

中國醫學科學院、北京協和醫學院微循環研究所；衛生部微循環重點實驗室，北京100005；#

，E-mail:xiurj@imc.pumc.edu.cn

本文2015-01-30收到，2015-05-13修回

R587.1

A

1005-1740(2015)03-0001-04