基于降低水稻谷蛋白多成員表達(dá)水平的干涉表達(dá)載體構(gòu)建

趙豐蘭，段永波，盛　瑋，薛建平

（淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/資源植物生物學(xué)安徽省重點實驗室，安徽　淮北　235000）

基于降低水稻谷蛋白多成員表達(dá)水平的干涉表達(dá)載體構(gòu)建

趙豐蘭，段永波，盛瑋，薛建平

（淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/資源植物生物學(xué)安徽省重點實驗室，安徽淮北235000）

摘要：通過水稻全基因組比對分析，獲得16個谷蛋白成員信息。序列比對獲得其保守區(qū)域，并選取其中129 bp構(gòu)建RNAi干涉載體，雙酶切驗證和測序結(jié)果表明干涉載體構(gòu)建成功。

關(guān)鍵詞：水稻；谷蛋白；RNAi干涉載體；保守區(qū)域

水稻為全球一半以上人口的主食，對保障全球糧食安全極為重要。同時水稻種子也是目前認(rèn)為最有潛力作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組藥用蛋白的“工廠”之一［1］。目前，限制水稻種子特異表達(dá)體系在重組藥用蛋白大規(guī)模應(yīng)用的主要因子是目標(biāo)基因表達(dá)量過低。外源基因表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后加工修飾等多層面的協(xié)同調(diào)控。已用于提高外源基因表達(dá)水平的策略包括使用強特異表達(dá)啟動子、改善蛋白運輸環(huán)境、提高翻譯效率、特定細(xì)胞器儲存等［2 -5］，都一定程度上提高了外源蛋白表達(dá)量。這些方法都是針對目的基因表達(dá)過程的直接改造以提高表達(dá)水平，該類體系已較成熟，如果再想大幅提高外源蛋白的表達(dá)量難度較大。

外源基因在表達(dá)過程中涉及與內(nèi)源相關(guān)蛋白對氨基酸和存儲空間的直接競爭［6］。2003年，Tada等將轉(zhuǎn)大豆球蛋白（glycinin）基因的常規(guī)水稻品種與日本晴的低谷蛋白水稻突變體（LGC-1）進(jìn)行雜交，LGC-1后代中g(shù)lycinin表達(dá)量比其親本日本晴的雜交后代提高120%，達(dá)到237 μg/g，暗示突變體中谷蛋白含量的降低提供了更多的氨基酸和空間供glycinin合成［7］。Kuroda等設(shè)計了一套包括抑制水稻內(nèi)源蛋白合成和種子特異表達(dá)外源目標(biāo)基因這2個表達(dá)框的植物表達(dá)載體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)源蛋白含量降低的轉(zhuǎn)基因水稻種子中綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)水平比抑制前顯著增強［8］。Kurokawa等篩選到霍亂毒素B亞基表達(dá)量顯著提高的轉(zhuǎn)基因株系，表明利用外源基因與相關(guān)內(nèi)源基因的競爭關(guān)系可提高外源蛋白表達(dá)水平，然而關(guān)于降低水稻種子內(nèi)源蛋白含量如何增強外源基因表達(dá)尚不清楚［9-10］。

另一方面，水稻種子具有調(diào)節(jié)各種內(nèi)源蛋白組成以保持其總蛋白含量于一定范圍的動態(tài)平衡機制。Maruta等利用RNAi技術(shù)降低水稻谷蛋白表達(dá)以改良水稻蒸煮品質(zhì)，結(jié)果檢測到種子的其他內(nèi)源儲藏蛋白含量增加［11］。Kim等在抑制水稻13 kDa醇溶蛋白合成改進(jìn)營養(yǎng)品質(zhì)的研究中發(fā)現(xiàn)，該醇溶蛋白顯著降低的同時，其他蛋白含量如10 kDa醇溶蛋白、谷蛋白和伴侶蛋白等增加［12］。綜合分析多個研究組的研究結(jié)果，無論低內(nèi)源蛋白突變體、RNAi降低內(nèi)源蛋白的水稻種子，還是以二者作為受體表達(dá)外源蛋白的種子，均與其野生型在總蛋白含量上無顯著差異，表現(xiàn)為各種內(nèi)源蛋白或與外源蛋白之間的此消彼長，說明水稻種子各種蛋白組分間存在一種動態(tài)平衡機制，使得其總蛋白含量維持于一恒定范圍［11-14］。

因此，以水稻中谷蛋白所有成員的保守區(qū)域為靶序列，通過RNAi技術(shù)降低谷蛋白的含量，可創(chuàng)制低谷蛋白的突變體，為提高外源重組蛋白表達(dá)水平奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

日本晴水稻種子由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所提供。

植物表達(dá)載體pCAMBIA1390RNAi骨架載體、大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α、根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105為淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院資源植物生物學(xué)安徽省重點實驗室課題組保存。

PCR擴增試劑為生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品，限制性內(nèi)切酶SacI、StuI、BamHI、MluI、T4 DNA連接酶均購自New England BioLabs （NEB）公司，膠回收試劑盒購自AxyGen Biosciences公司，pMD18-T vector購自TaKaRa生物工程（大連）有限公司，卡那霉素、氨芐青霉素鈉鹽和利福平等購自生工生物工程（上海）股份有限公司，引物和基因合成以及測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2方法

1.2.1水稻谷蛋白基因及其保守區(qū)域分析通過NCBI軟件分析水稻全基因組范圍內(nèi)谷蛋白分布情況，并采用Blast程序?qū)λ@成員的保守區(qū)域進(jìn)行分析。選定其中部分保守序列作為靶位點設(shè)計引物，構(gòu)建RNAi干涉表達(dá)載體（表1）。

表1　RNAi干涉表達(dá)載體構(gòu)建所用引物序列

1.2.2靶片段的獲得及載體構(gòu)建以日本晴基因組DNA為模板擴增正義和反義靶片段。PCR擴增體系（50μl）如下：5 μl 10×PCR buffer，4 μl 25 mmol MgCl2，4 μl 2.0 mmol dNTPs，2 μl 10 μmol上下游引物，0.4 μl 5 U/μl Taq DNA聚合酶，100 ng DNA模板，ddH2O至50 μl。PCR擴增條件為94℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s進(jìn)行30循環(huán)。PCR產(chǎn)物連接至pMD18-T vector，挑取PCR陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3RfTNFR-Fc種子特異表達(dá)載體構(gòu)建以SacI/StuI對pCAMBIA1390RNAi骨架載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和含有正義片段的pMD18-T vector載體，回收片段后進(jìn)行T4DNA酶重組連接；提取所獲陽性菌落質(zhì)粒進(jìn)行BamHI/MluI雙酶切使載體線性化，同理將反義片段連入表達(dá)載體。提取陽性克隆質(zhì)粒以相應(yīng)內(nèi)切酶進(jìn)行正義片段和反義片段的酶切驗證，鑒定正確的克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.4表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌將測序驗證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞。取2 μg質(zhì)粒DNA加入從-70℃超低溫冰箱取出的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，混勻后冰浴30 min；轉(zhuǎn)入液氮速凍1 min；加入1 ml YEP培養(yǎng)基（不含抗生素），30℃、120 r/min培養(yǎng)4 h；4 000 r/min離心1 min，棄上清；加150 μl YEP培養(yǎng)基（不含抗生素）重懸，將菌液涂布與含50 μg/ml Kan和10μg/ml Amp的YEP固體平板；28℃培養(yǎng)48 h至單菌落長出，進(jìn)行菌落PCR鑒定。

2　結(jié)果與分析

2.1水稻中谷蛋白同源性分析

以谷蛋白基因Os10g0400200全長序列（1540bp）對水稻全基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索比對，獲得16個谷蛋白基因信息（Os10g0400200、Os01g0762500、Os02g0249800、Os02g0249000、Os02g0249600、Os02g0268300、Os02g0268100、Os02g0248800、Os02g 0242600、Os02g 0453600、Os02g 0249000、Os03g 0427300、Os12g 0155200、Os08g 0127900、Os11g 0153400、Os05g0170300）。通過NCBI Blast軟件對這些基因進(jìn)行全長比對，結(jié)果表明其同源性極高（圖1）。選取其中部分保守區(qū)域作為靶位點，序列為：tttgataggttgcaagcatttgagccaattcggagtgtgaggtctcaagctggcacaactgagttcttcgatgtctctaatgagttgtttcaatgtaccggagtatctgttgtccgccgagttattgaa。以該區(qū)域為靶序列可能同時抑制所有谷蛋白基因的表達(dá)。

圖1　水稻谷蛋白基因的同源性比對

2.2表達(dá)載體構(gòu)建

回收PCR片段后連入T載體，分別酶切后與相應(yīng)的酶線性化的載體進(jìn)行連接，對所獲重組子進(jìn)行正義片段和反義片段的酶切驗證。酶切結(jié)果顯示，所獲表達(dá)載體中含有129 bp的正義和反義片段（圖2）。測序結(jié)果表明，正義和反義片段已正確連入pCAMBIA1390 RNAi骨架載體。

M為genomic DNA marker II；1為正義片段酶切結(jié)果；2為反義片段酶切結(jié)果。圖2重組子正義和反義片段的雙酶切驗證

2.3重組子導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌

提取測序正確克隆的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，液氮速凍和恢復(fù)培養(yǎng)后涂于含卡那霉素和利福平的YEP平板。培養(yǎng)2 d后獲得大量轉(zhuǎn)化克隆（圖3），菌落PCR表明重組質(zhì)粒已導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105。

圖3　陽性農(nóng)桿菌克隆

3　結(jié)論

谷蛋白是水稻種子中含量最高的儲藏蛋白，其含量占總蛋白的80%左右，包括至少12個編碼基因［3］。通過敲除或降低谷蛋白表達(dá)，對提高外源基因的表達(dá)水平很有意義和潛力。該研究通過水稻全基因組比對分析，獲得16個谷蛋白成員信息。序列比對獲得其保守區(qū)域，并選取其中129 bp構(gòu)建RNAi干涉載體，雙酶切驗證和測序結(jié)果表明干涉載體構(gòu)建成功。

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（本文責(zé)編：金蘋）

通訊作者：薛建平（1966—），男，河南溫縣人，教授，博士，主要從事植物生物技術(shù)研究。E-mail：xuejp@163.com

作者簡介：趙豐蘭（1979—），女，安徽壽縣人，講師，碩士，主要從事植物生物技術(shù)研究。E-mail：zhaofenglan1997@163. com

基金項目：安徽省教育廳省級高校自然科學(xué)基金重點項目（KJ2014A226）

收稿日期：2015-07-11

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2015.09.011

中圖分類號：S511

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-1463（2015）09-0028-04