DC-CIK治療難治性多發性骨髓瘤的臨床研究

徐　源

作者單位：250062 山東省濟南大學醫學科學院醫學與生命科學學院；272011 山東省濟寧市第一人民醫院

DC-CIK治療難治性多發性骨髓瘤的臨床研究

徐源

作者單位：250062 山東省濟南大學醫學科學院醫學與生命科學學院；272011 山東省濟寧市第一人民醫院

【摘要】目的探討樹突狀細胞(DC)和細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)治療難治性多發性骨髓瘤的療效和安全性。方法41例難治性多發性骨髓瘤患者，根據患者意愿分為22例實驗組和19例對照組。將實驗組自體DC-CIK細胞進行體外擴增，再過繼回輸進行治療。對照組患者接受維持治療。對過繼治療前后患者的免疫指標以及臨床療效進行對比和觀察。結果誘導后CD表面CD1a、CD83、CD86和HLA-DR分子陽性率均較誘導前顯著提高，差異有統計學意義(P<0.01)。誘導后DC-CIK表面CD3、CD8和CD56陽性率均較CIK有顯著提高，差異有統計學意義(P<0.01)。治療3個月后，實驗組患者QOL、Ag-NOR和外周血IL-12等指標均較對照組有顯著優化，差異有統計學意義(P<0.05)。3個月治療后，實驗組患者腎功能、24 h 尿液輕鏈、血清M 蛋白、β2-M、骨髓瘤細胞比例均相較對照組有顯著改善，差異有統計學意義(P<0.05)。結論DC-CIK過繼治療難治性MM具有較好的臨床療效，可幫助患者帶瘤長期生存，獲得較大受益。

【關鍵詞】細胞因子誘導的殺傷細胞 ；樹突狀細胞；多發性骨髓瘤；過繼治療

Clinical Study of DC-CIK for Refractory Multiple Myeloma

XUYuan.CollegeofMedicineandLifeScience，JinanUniversity，Jinan，250062

【Abstract】ObjectiveTo explore the clinical efficacy and security of dendritic cells(DC) and cytokine induced killers(CIK) in the treatment of refractory multiple myeloma (MM).Methods41 patients with refractory MM were divided into the experimental group and the control group according to their willings，there were 22 cases in the experimental group and 19 cases in the control group.The autologous DC-CIK cells were amplificated in vitro and then for reinfusion treatment.The control group received maintenance therapy.The immune parameters and clinical effects before and after treatment were compared and observed.ResultsAfter induction，the positive rates of CD1a，CD83，CD86 and HLA-DR molecules on CD surface improved significantly，the difference was statistically significant (P<0.01).After induction，the positive rates of CD3，CD8 and CD56 molecules on CD-CIK surface improved significantly than those of CIK，the difference was statistically significant (P<0.01).After 3 months of treatment，The QOL，Ag-NOR and peripheral IL-12 of patients in the experimental group were all significantly optimized compared to the control group，the difference was statistically significant (P<0.05).After 3 months of treatment，the renal function，urine light chain，serum M protein，β2-M and the proportion of myeloma cells were significantly improved compared to the control group，the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionDC-CIK for refractory MM has good clinical effect，it can improve long-term survival of patients with tumors with large benefit.

【Key words】Cytokine-induced killer cells；Dendritic cells；Multiple myeloma；Adoptive therapy

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:0454～0456)

多發性的骨髓瘤(multiple myeloma，MM)為來自漿細胞的一類惡性腫瘤，具有較高發病率，大約占到惡性腫瘤總數的1%，占到惡性血液腫瘤總數的10%左右，而且發病率會隨年齡增長不斷增高，此外骨髓瘤病人治療后易反復，預后差，當前還不能完全治愈[1]。目前對于難治性MM還沒有一個有效統一的方案。細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine induced killers，CIK)是將人骨髓或外周血的單個核細胞于體外培養所得的一類異質性的細胞，其具備T淋巴細胞的抗腫瘤的活性外，還具有非MHC限制性的殺瘤能力，殺傷活性據報道可達84.7%[2]。樹突狀細胞(dendritic cells，DC)為人體內專職進行抗原呈遞最有效的細胞。通過攜帶腫瘤抗原DC施行免疫治療，可以刺激患者機體發生特異性的T細胞免疫反應。本研究自2009年3月-2014年3月間于對22例難治性MM患者進行DC-CIK過繼治療，臨床療效較好，具體報告如下。

1資料與方法

1.1　一般資料

實驗組22例患者包括13例男性，8例女性，年齡為44～81歲，中位年齡57歲，臨床分型：11例IgG型，4例IgA型，2例IgD型，4例λ鏈型，1例κ鏈型。DurieSalmon分期：5例Ⅱ期，17例Ⅲ期；對照組19例患者包括11例男性，8例女性，年齡為42～83歲，中位年齡55歲，臨床分型：13例IgG型，2例IgA型，1例IgD型，2例λ鏈型，1例κ鏈型。DurieSalmon分期：4例Ⅱ期，15例Ⅲ期。兩組患者的年齡、性別、分期等一般情況比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2　納入標準[3]

① 均經病理檢查診斷為MM；②均經TD(地塞米松+沙利度胺)、DVD(地塞米松+長春新堿+脂質體的阿霉素)、PAD(地塞米松+阿霉素+硼替佐米) 等方案治療后發展為難治性MM。③患者知情后，同意接受DC-CIK治療者進入實驗組，并簽署知情同意書，不同意者進入對照組。

1.3　排除標準

①有禁忌癥患者；②化療仍可受益者；③情況非常差或處于臨終狀態。

1.4　材料與試劑

酶標儀Elx800 Bio-Tek、流式細胞儀購自BD公司；由FITC標記的CD3、CD8、CD56、CD83、HLA以及CD86單克隆抗體(mAb)，PE標記的HLA ⅡmAb、CD56，IL-1α、IL-2、TNF-α、rhIL-4、rhGM-CSF和RPMI 1640培養液購自Hyclone公司；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒和IL-12、IFN-γ ELISA檢測試劑盒購自Roche公司；淋巴細胞的分離液購自上海第二制藥廠；銀染液、固定液、細胞的低滲液等相關配套試劑和免疫圖像的分析系統，均購自北京健爾康醫療設備有限公司。

1.5　治療方法

1.5.1DC-CIK的誘導首先參考文獻[4]取得實驗組患者外周血中單個的核細胞(PBMC)，1.0×1010~5.0×1010，孵箱中進行2 h貼壁，將懸浮細胞抽取(細胞數為1×106/ml)后加入到含有IL-1(100 U/ml)、IL-2(500 U/ml)、CD3 mAb(100 ng/ml)、IFN-γ(1 000 U/ml)的1640液中，進行CIK培養，每46 h將培養液更換一次，于第7 d進行收集。剩余貼壁細胞加入IL-4和GM-CSF(最終濃度是125 ng/ml)，新鮮因子每3 d補充一次，第6 d加入5 μg/ml(終濃度)自體Ag(Ag-DC)。取培養到第8 d的Ag-DC和PBMC，分別加入10 μl FITC標記的CD86 mAb、CD83 mAb及10 μl PE標記的HLA ⅡmAb，通過流式細胞儀進行測定。將收集到的CIK培養液分為2組，其中1組為單純CIK培養液，另外1組把Ag-DC和CIK按照1∶10的比例進行共同培養(Ag-DC-CIK)。分組后繼續培養24 h，取培養第8 d的Ag-DC-CIK、CIK和PBMC，加入FITC標記mAb對CD3表達進行檢測，加入PE標記mAb對CD8、CD56進行檢查。于培養第7 d把Ag和CIK按照1∶10的比例共同培養。

1.5.2細胞回輸于每次治療之前48 h，對CIK和DC進行內霉素、真菌和細菌檢測，確認無污染之后，在培養第14 d，把Ag-DC致敏的CIK細胞進行離心和洗滌，通過20萬單位的rhIL-2、25 ml的人血白蛋白及100 ml的生理鹽水重懸細胞，并于2 h捏回輸至患者的體內，在回輸之前給患者肌注25 mg非那根。

1.5.3細胞的免疫表型分析培養第8 d抗原負載DC，將CD1a、CD86、HLA-DR、CD83、CD80mAb分別加入，通過流式細胞儀對成熟前后DC免疫表型進行檢測。將培養第14 d的DC-CIK和單獨CIK細胞進行收集，FITC標記的CD8、CD56和CD3mAb分別加入，通過流式細胞儀對免疫表型進行檢測。

1.6　療效評價[5]

治療前與治療之后6個月患者生活治療(QOL)通過PS(Performance Status)評分法(5分法)進行評分；對連續24 h內收集尿液的輕鏈含量、骨髓瘤漿細胞的百分數、β2微球蛋白(β2-M)、尿素氮(BUN)和血清肌酐(Scr)的水平進行記錄。療效評定標準參照歐洲血液和骨髓移植協作組(EBMT)制定的標準，包括疾病進展(PD)、輕微反應(MR)、部分緩解(PR)、接近的完全緩解(nCR)和完全緩解(CR)。兩組患者PBMC于相同時間進行分離和銀染，通過KL系統對淋巴細胞的銀染區和核面積比例(IS%)進行計算。

1.7　不良反應評價[6]

不良事件參照CTCAE(common terminology criteria for adverse events，美國國立癌癥研究所制定)制定的標準記錄。

1.8　統計學處理

研究數據的統計分析采用SPSS 17.0統計分析軟件，計數資料之間采用卡方檢驗進行比較分析，使用t檢驗比較分析計量資料之間的差異，統計結果以P<0.05表示有顯著性差異。

2結果

2.1　誘導前后DC的免疫表型比較(表1)

誘導之后CD表面CD1a、CD83、CD86和HLA-DR分子陽性率均較誘導前有顯著提高，差異有統計學意義(P<0.01)。

表1　誘導前后DC的免疫表型比較

2.2　培養前后DC-CIK 細胞細胞表型表達水平比較

誘導后DC-CIK表面CD3，CD8和CD56陽性率均較CIK有顯著提高，差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表2　培養前后DC-CIK 細胞的細胞表型

2.3　2組患者QOL及免疫學的指標對比

治療3個月后，實驗組患者QOL、Ag-NOR和外周血IL-12等指標均較對照組有顯著優化，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3　兩組患者QOL及免疫學的指標對比±s)

注：*為兩組治療后相比，χ2=17.0015，P<0.05。

2.4　治療前后兩組患者病情的評估指標對比

治療3個月后，實驗組患者腎功能、24 h 尿液輕鏈、血清M 蛋白、β2-M、骨髓瘤細胞比例均較對照組有顯著改善，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

3討論

MM 為漿細胞惡性疾病，至今仍無法治愈。新一代的藥物硼替佐米可以提高患者生存期，然而其副反應以及高昂費用使其應用受到了極大限制，仍然需要對有效治療方案進行探索。細胞免疫過繼療法(adoptive cellular immunotherapy，ACI)通過向腫瘤患者輸入非特異性活特異性的能夠對腫瘤細胞產生抑制作用的效應免疫細胞，對腫瘤細胞直接殺傷或者對患者自身免疫反應進行誘發從而達到抑制乃至治療腫瘤目的[7]。

表4　治療前后兩組患者病情的評估指標對比

注：*為兩組治療后比較，χ2=17.0822，P<0.05。

CIK為具有最高殺傷活性的體內效應細胞。可以對CD3+，CD56+同時表達，具有T細胞的特異性免疫能力外，同時具備NK細胞的非MHC限制性免疫能力，可以高效精確地對癌細胞進行殺傷而不對正常細胞造成損傷，其殺傷活性約是LAK細胞50倍。CIK細胞優勢包括高殺瘤活性、高增殖速度、殺瘤和抗凋亡效應免于癌細胞多藥耐藥影響等。DC為抗原的呈遞細胞中功能最強的一類，在受到Ag刺激之后，活化狀態DC可為CIK提供有效啟動信號，從而對MM泛特異性的殺傷進行誘導。Ag刺激的CIK可以對瘤細胞進行主動識別，其相較單純的CIK殺傷活性有顯著提高，可以明顯降低腫瘤的逃逸率。本研究結果，聯合培養DC與CIK后，CD3、CD8和CD56陽性率均有顯著提高，差異有統計學意義(P<0.01)。

當前，已有報道通過腫瘤的裂解物對DC免疫致敏以治療轉移性晚期實體腫瘤，并取得了一定臨床療效，然而使用DC-CIK用于MM治療的臨床研究報道仍較少。DC-CIK用于MM治療具有下列優勢：①可對隱匿的瘤細胞進行反復殺傷和清除；②可通過細胞因子的分泌以激活免疫抗瘤；③可使器官功能得到改善，使化療的不良反應得到緩解；④不會損傷正常組

織[8]。本研究中實驗組患者接受DC-CIK的過繼治療之后，其QOL及24 h尿液輕鏈、β2-M、血清M蛋白、瘤細胞的百分比、腎功能相較于治療前均有顯著改善，差異有統計學意義(P<0.05)。此外患者外周血的淋巴細胞Ag-NOR IS值提高顯著，表明細胞治療使患者淋巴細胞的活性得到了增強，使其機體的抗瘤能力得到了增強，最終提高了MM近期的治療效果。本研究中患者接受DC-CIK過繼治療后僅個別出現短暫低熱、畏寒，癥狀在處理后緩解，沒有其他的不良反應。綜上所述，DC-CIK過繼治療難治性MM具有較好臨床療效，可幫助患者帶瘤長期生存，獲得較大受益。

參考文獻

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[2]鐘國成，顏斌，孫薏，等.DC-CIK 過繼免疫聯合化療治療多發性骨髓瘤的療效分析〔J〕.中華血液學雜志，2012，33(12)：1000-1003.

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[8]Wang J，He M，Shi W，et al.Inducible costimulator(ICOS)enhances the cytolytic activity of cytokine induced killer cells against gallb ladder cancer in vitro and in vivo〔J〕.Cancer Invest，2009，27(3)：244 - 250.

(編輯：吳小紅)

(收稿日期2014-09-09修回日期 2014-12-15)

中圖分類號：R733.3

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5930(2015)03-0454-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.03.044