原子力顯微鏡在生命科學領域研究中的應用進展

鞠安，蔣雯，許陽，楊升，常寧，王鵬，顧寧

(東南大學 生物科學與醫學工程學院，江蘇 南京 210009)

·綜 述·

原子力顯微鏡在生命科學領域研究中的應用進展

鞠安，蔣雯，許陽，楊升，常寧，王鵬，顧寧

(東南大學 生物科學與醫學工程學院，江蘇 南京 210009)

在微納尺度上對細胞及相關的生物學過程進行觀察是近年來的熱點。原子力顯微鏡(AFM)以其納米級別的分辨率、超高的靈敏度以及對各種工作環境良好的兼容性而被廣泛應用于生命科學領域。作者介紹AFM在細胞性質、細胞或生物大分子間相互作用以及觀察動態生物過程等方面的研究進展，歸納傳統AFM存在的主要問題以及近年來針對這些問題作出的改進。

原子力顯微鏡； 生命科學； 研究進展； 問題與改進； 文獻綜述

原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)，是掃描探針顯微鏡(scanning probe microscopy)的一種。它的核心結構是一個對力非常敏感的微懸臂，其尖端有一個微小的探針。當探針靠近樣品表面時，探針尖端的原子與樣品表面的原子之間產生極其微弱的作用力，從而使微懸臂彎曲。探測器將微懸臂的形變信號轉換成光電信號進行放大，就可以得到原子之間力的微弱變化的信號，獲得作用力分布信息，從而以納米級分辨率獲得表面形貌結構信息及表面粗糙度信息(如圖1)。正是由于AFM具有微納級別的空間分辨率以及皮牛頓級別的測力靈敏度[1]，它漸漸成為研究活細胞表面形貌、結構以及生物過程的強有力的工具，在生物學領域得到廣泛應用。

1 AFM應用于生命科學領域的優勢

自1675列文虎克發明光學顯微鏡以來，人們就開始利用顯微鏡這個平臺來觀察微觀世界。后來，電子顯微鏡(EM)、掃描隧道顯微鏡(STM)、掃描探針顯微鏡(SPM)等相繼問世。然而，光學顯微鏡由于可見光波長的限制，精度和分辨率遠遠達不到觀察生物過程的要求；無論是透射EM還是掃描電子顯微鏡，都是利用打到樣品表面的高速電子束來反映樣品形貌特征，勢必涉及對樣品一定程度的損傷；STM是利用隧道效應，檢測隧穿電流，因此一般也要求樣品為導體或半導體。與這些顯微鏡對技術和樣品的高要求相比，AFM有著以下幾點明顯的優勢：(1) 樣品制備簡單，對樣品的破壞較其他技術小得多，無須經歷電子束的轟擊或者免疫組化的熒光染色過程；(2) AFM比一般的STM更有優勢的地方在于，它可以在液態環境下檢測絕緣物質，尤其是在生理學環境下[2]；(3) 能提供生物分子的高分辨率的圖像；(4) 觀察生物大分子之間的相互作用，如受體-配體、生物素-親和素、抗原抗體等；(5) 能利用針尖對單細胞、單分子進行操作，如在細胞膜上打孔、切割染色體等，也可以輔助研究一些細胞生物學領域的問題，比如信號、細胞分化、細胞黏附等[3]；能與其他顯微鏡等技術互補，從多個角度共同展現生物過程。

圖1 AFM的成像原理

Fig 1 The Imaging principle of AFM

2 AFM在細胞生物學中的應用

基于AFM較其他顯微技術的無可比擬的優勢，前人已經利用這個平臺在生物醫學領域進行了卓有成效的研究工作，從多個角度深入探究了生命科學領域中值得關注的問題。

2.1 AFM對細胞膜表面形態的研究

細胞膜有重要的生理功能，它既使細胞維持穩定代謝的胞內環境，又能調節和選擇物質進出細胞。AFM能夠觀察到細胞膜表面的超微結構，因此它可以用來觀察正常細胞與病變細胞的細胞膜，發現兩者的異同，為臨床病理診斷提供新的視角和方法。

Braga等[4]在生理條件下觀察了大腸桿菌受抗生素作用后外膜的形態變化，所獲得的AFM圖像清楚地顯示出外膜上有由成百上千個脂多糖分子(LPS)組成的突起，他們認為就是這些LPS斑塊有效地控制著大腸桿菌的外膜通透性。關維等[5]用2%的福爾馬林溶液和枸櫞酸鹽緩沖液制備AFM樣品，分別觀察了人成纖維細胞(Fb cell)、人宮頸癌細胞(Hela cell)、人乳腺癌細胞(Mcf7 cell)、人成纖細胞癌變細胞(Ma-Fb)。當掃描范圍為500 nm時可見到Fb細胞膜是由圓形、橢圓形等大小較一致的隆起組成，結構比較飽滿、光滑，隆起的凹陷排列疏密程度適中。而癌變細胞膜隆起結構明顯增大增高，細胞膜由圓形、三角形、多角形、不規則形等多種形狀的隆起構成，彼此之間形成的縫隙也變得凸凹不平，排列疏密不均，相對紊亂。邢曉波等[6]用AFM研究不同刺激條件下T細胞的形態和生物力學特征，發現靜息的T細胞呈較為規則的圓形，細胞表面相對光滑均一，而經過超抗原SEA和植物凝集素PHA活化的T細胞膜表面粗糙度增大，細胞表面形成100 nm～1 μm的顆粒狀團簇結構。而且他們還發現不同的刺激劑對T細胞的活化程度不同，從而會導致不同的形態結構和膜納米結構。

2.2 AFM測定細胞彈性以及力學性質

病變這一生理過程與細胞的形態和力學性質有關。細胞形態學的變化會影響和反映細胞性質、功能以及細胞微環境的改變。健康細胞與病理狀態的細胞在機械性能上是完全不同的。抓住這一點，可以利用AFM測量出的細胞彈性性質識別癌細胞，以及輔助診斷紅細胞相關的各種疾病等，從細胞層面上對各種疾病進行早期診斷和治療。

楊氏模量可視為衡量材料產生彈性變形難易程度的指標，其值越大，使材料發生一定彈性變形的應力也越大。大量研究表明，腫瘤細胞與正常細胞的楊氏模量是不同的，這說明了楊氏模量可以作為一個新的腫瘤標記。已知彈性常數的AFM微懸臂探針用于力曲線檢測已成為目前研究生物微觀力學不可或缺的強有力的工具。AFM所獲得的力-距離曲線的斜率就是樣品的彈性模量[7]。Ding等[8]利用AFM獲得了宮頸鱗癌細胞的楊氏模量等力學參數，分析了正常細胞和癌變細胞彈性性質的不同。與傳統的細胞學分析方法相比，AFM檢測分析的方法可以避免實驗中主觀因素相互干擾帶來的假陽性或者假陰性。他們也利用高分辨率的成像技術如環境掃描電子顯微鏡(ESEM)拍攝了細胞表面的形態，驗證了AFM圖像的分析結果。Cross等[9]檢測了體外培養24 h的腫瘤細胞的模量，發現它們比正常細胞要柔軟70%。這些腫瘤細胞是從肺癌、乳腺癌和胰腺癌病人的胸膜積液中取得的。Lekka等[10]也發現人類膀胱上皮腫瘤細胞的硬度和可變形性比正常細胞有所下降。此外，他們也利用AFM對45個患有冠狀動脈疾病、高血壓和糖尿病的病人和13個健康人的紅細胞模量進行了對比研究[11]。從每個血樣中隨機選取20個左右的紅細胞，在每個細胞表面選擇20～30個點進行測量，以獲取細胞彈性模量的分布。糖尿病患者和吸煙者血液中紅細胞模量平均值和寬度分布相比健康人都明顯增大，而且模量平均值與病人年齡相關。利用這些統計數據，我們可以對病人進行年齡分布、病變程度等早期診斷和治療，為疾病的預測提供便利。

2.3 AFM檢測活細胞間相互作用

AFM也可以對細胞間的相互作用進行觀察[12]。將一種細胞連接在AFM掃面探針的尖端，使針尖功能化，對另一種單層排列的細胞進行掃描就可以進行細胞間相互作用的研究(如圖2)。如Thie等[13]利用AFM第一次界定了滋養細胞和子宮內皮細胞間的相互作用。他們在微懸臂上修飾上微珠，再將滋養細胞包被在微珠表面，去接近單層排列的子宮內皮細胞，用AFM獲得兩者之間作用力變化的情況。Omidvar等[14]將T47D細胞附著在包被了伴刀豆球蛋白A的微懸臂上，該微懸臂作為檢測兩個T47D細胞間黏附力的探針，來測量細胞間的局部剛度。首先帶有T47D細胞的微懸臂靠近培養的細胞，讓兩個細胞相互接觸。在一定的時間之后，微懸臂被拉回。兩個細胞之間持續作用，直到兩個細胞完全被分開。微懸臂的垂直偏轉與針尖的細胞作用力成正比。AFM的這一作用，對研究多細胞生物體中細胞間的相互作用有重要啟示，例如可研究動物胚胎移植中細胞的免疫排異反應，還可以研究在病灶處病變細胞與健康細胞間有著怎樣的界限，如何相互影響相互作用并達到一種動態平衡等過程。

圖2 AFM觀察細胞間相互作用

Fig 2 Observing interactions between cells by AFM

2.4 AFM觀察動態生物過程

AFM也是觀察細胞生物過程非常有效的工具[15]。Haberle等[16]用AFM記錄了單個病毒顆粒從被感染細胞中釋放的過程。類似地，Ohnesorge等[17]研究了痘病毒和活細胞，得到了痘病毒感染活細胞全過程的AFM圖。通過活著的細胞觀察子代病毒顆粒，并用AFM在水溶液環境中在分子水平分辯出有規則重復的烙鐵狀結構和準有序的環狀結構。觀察中發現：在感染前后最初幾小時，細胞并無顯著變化；子代病毒粒子沿細胞骨架進入細胞內部，還有胞吐、病毒顆粒聚集等現象。通過AFM圖像可以看出啞鈴狀小泡逐漸形成、消失并在細胞膜表面形成凹陷的全過程。Yamashita等[18]發現了趨磁細菌細胞表面的網狀結構。他們發現，細胞外膜完全被一種網狀結構所覆蓋，在這種結構的邊緣有很多孔蛋白顆粒。用AFM追蹤網孔的運動軌跡，動力學圖像揭示了在小孔邊緣的顆粒是如何進出這些結構的。第一次用AFM觀察到了活細胞表面的分子動力學，直接展示了孔蛋白類結構在磁性顆粒穿過細胞膜的過程。Yokokawa等[19]將兔子肌肉中的鈣離子泵提純出來，放在云母板上的脂質環境中，用fastXY模式(可以實現顯微鏡樣品電動化XY軸定位的一種掃描模式)來檢測鈣離子泵運動的動力學過程。他們發現這一過程受到鈣離子和ATP的共同影響，而且在一種鈣離子泵抑制劑毒胡蘿卜素的存在下，動力學過程被明顯地抑制。

2.5 AFM觀察生物大分子之間相互作用

除了活細胞層面的相互作用，生物大分子之間相互作用也能深刻反映出生命活動的本質。

蛋白質是生命活動的承擔者，是生命的物質基礎，調節著人體內各種生命現象的過程，作為遺傳物質的基因也必須經過蛋白表達之后才能體現遺傳形狀。Yokokawa等[20]研究了細胞內與蛋白質折疊調節相關的分子伴侶的行為。GroEL是大腸桿菌中的一種分子伴侶，而GroES是它的輔分子伴侶。當GroES與GroEL結合后，AFM圖像顯示它能誘導近端GroEL的一個構型變化，增加中心孔洞的體積。當中心孔洞可以與不成熟蛋白接觸時，在ATP下可以看到GroEL分子由閉環狀態變成開啟的狀態。AFM所得的數據也可以清晰顯示出開啟形態的GroEL比閉合的有更高的結構。

在生物體內，DNA與蛋白質間的相互作用有著同樣舉足輕重的地位。在轉錄、翻譯的過程中，DNA與特定的蛋白質如解旋酶、聚合酶、啟動因子等的結合就決定著生命活動的開啟。Gilmore等[21]利用AFM以每500ms拍攝1次的速度，清晰地觀察到了蛋白質在DNA上的結合情況。因此，AFM可以真正幫助我們深入地“看到”生命活動的本質。

2.6 AFM測定細胞電學性質

細胞不論在靜止狀態還是活動狀態，都會產生與生命狀態密切相關的、有規律的電現象，生物電信號包括靜息電位和動作電位，其本質是離子的跨膜流動。因此，研究細胞的電生理學也成為了生命科學領域一個重要的分支。

張文曉[22]在AFM系統中增加了導電模塊，在迎春花細胞、酵母菌細胞等樣品和探針之間加一個偏壓，在掃描的過程中，同時獲得樣品的表面形貌和電流像，且在成像的同時檢測探針和細胞樣品之間的電流(如圖3)，得到樣品表面形貌和局域電流分布及兩者之間的對應關系，從而實現AFM在納米尺度上對細胞樣品電學特性的分析檢測。同個細胞的不同位置所體現的細胞導電性是有所差異的，細胞核、細胞器所在的位置與細胞質的導電性有所差別，細胞中間部分與細胞膜邊緣的導電性也不盡相同。可以將整個細胞的導電性看作一個滑動變阻器，而AFM探針可以針對各個阻值進行測量。因此，基于AFM探針對同一個細胞的不同位置進行測量，為檢測癌細胞等可能出現的多核現象提供了可能。

3 AFM應用遇到的主要問題

隨著納米技術的不斷深入發展，研究人員對AFM儀器的功能要求越來越高。AFM在生命科學領域的表征、測量以及操作方面的不足主要體現在以下幾個方面。首先是定位精度不高。由于機械加工技術的限制，作為驅動器的壓電陶瓷存在著遲滯、蠕變等非線性因素導致定位準確性不夠好。當成像速度、掃描范圍加大的時候，非特異性識別的現象就更加明顯[23]。其次是成像速度較慢。由于駐點掃描的成像原理，AFM的成像速度不及傳統的顯微鏡。另一方面，AFM內嵌的控制與成像算法尚未達到超高速掃描的要求。此外，由于微懸臂在幾何結構上的二態構造導致的不對稱，當長時間持續掃描樣品的時候會產生針尖的漂移[24]。AFM工作時，一般要求生物樣品被放置在平的云母基底上且需要被固定住。但在研究動力學過程時，固定化就會在一定程度上阻止正常的生物活動，導致這些過程的三維結構很難被拍攝到。因此在動力學AFM的研究中，固定分子的技術有著很大的講究，必須保證分子依然可以在空間上自由，保持接近生理學狀態[21]。此外，針尖的尺寸也是影響圖像質量的重要因素。越粗糙的樣品，受針尖尺寸的影響越明顯。針尖尺寸越小，表面形貌越不失真，但是尺寸越小，技術難度越大。

圖3 AFM導電模塊示意圖

Fig 3 Schematic diagram of the Conductive Module

4 針對傳統AFM的技術改進

基于傳統的AFM存在的一些技術上的瓶頸，近年來國內外眾多團隊致力于在硬件和軟件上進行改善，取得了一定的成果和進展。

4.1 AFM與其他顯微技術和設備結合

Chaudhuri等[25]用側視熒光顯微鏡和AFM結合，觀察負載軸上細胞變形和細胞骨架的重排。實驗可觀察到細胞形狀的變化、力誘導的破裂導致的細胞形狀的相關變化以及在細胞間粘連的過程中細胞膜絲形成的過程。測量細胞收縮力的時候，還可以觀察細胞骨架的重排以及應力纖維的形成。SR超分辨率熒光顯微鏡已經超越了傳統的熒光顯微鏡，它的橫向分辨率已經可以達到納米級別。比如雙色受激發射損耗(STED)顯微鏡。把STED與AFM結合，STED共聚焦圖像相當于用作AFM移動的地圖，讓AFM找到目標分子或者細胞[26]。目前，也有“隨機光學重建顯微鏡”(STORM)與AFM配合的，可以拍攝出單分子水平的圖像。Suzuki等[27]對AFM的工作模式進行了改造，使得固定在微懸臂上的探針在XY方向掃描 ，而不是樣品臺在XY方向掃描。這就意味著“解放”了樣品，使其可以被放到透明的基底上，用熒光或者可見光去研究，用倒置的光學顯微鏡去看。

4.2 高速AFM

近年來應用較為廣泛的是響應速度更快的壓電驅動器。它可以提升AFM的掃描速度，使得AFM成像的時間間隔更小，在一定程度上趨近實時圖像；或通過重新設計掃描器結構，從機械結構上降低水平方向振動對豎直方向的耦合影響，進而提高了高速掃描時的成像精度。日本金澤大學的科研團隊則使用3塊壓電陶瓷分別控制樣品臺3個方向上的運動，取代了運動耦合誤差較大的管式掃描器，實現了對活性蛋白的連續成像[28]。

4.3 探針針尖的修飾與改造

Shibata等[29]用無定型碳做了一個極長(3 μm)極薄(直徑5～8 nm)的針尖，讓它在力常數為200 pN·nm-1的軟微懸臂上垂直生長。這種新型的設計可以使得微懸臂在輕敲模式(自由振幅約為100 nm，頻率為800 kHz)下掃描的時候，與細胞之間的碰撞達到最小，同時成像時保持較高的空間分辨率。用該設備觀察mEGFP轉染的COS-7細胞表面形態動力學，發現它對細胞的成像可以保持1 h以上，不對細胞產生任何明顯的損傷。同時發現細胞的前緣有膜的褶皺、延伸以及絲狀偽足的回縮。這種長期的成像穩定性可以把細胞對于外界刺激的形態學動力學反應可視化，比如在靶向給藥或者受體配體相結合的過程中，就需要長期穩定的監測。將該設備與高級光學顯微鏡結合，還可以進一步證實蛋白質功能以及細胞活動，甚至了解更多分子作用以及細胞內信號轉導的信息。

4.4 算法改進

除了在硬件上對AFM設備進行改進，研究人員同樣致力于改善內嵌的控制算法。針對微懸臂在持續長時間掃描的過程中產生的漂移問題，Spagnoli等[24]開發了一種叫作Stick-and-Move(SaM) Routine的新算法，使微懸臂首先掃描細胞表面的興趣位置，直到達到了一定的力的限度(一般是100 pF)然后被拉回基底，再測一個力與距離的曲線。信號代表了兩個峰，一個是接觸基底，一個是接觸細胞。用Python語言進行數據分析之后，可以在細胞位置的峰上減去基底的峰，同樣得到持續掃描樣品的等價信號，從而進行力-距離曲線的分析。除了針對單細胞分析過程中的算法改進，張文曉[22]解決了原子力探針在對同種類大量活體細胞進行反復測量的過程中，耗時過長會減少細胞存活率或是細胞分裂引起的目標混亂的問題。主要是采用“蟻群算法”對探針進行路徑的最優規劃，使探針行走的路徑最短，用時最少。

5 總結與展望

AFM能在固體表面達到微納級別的分辨率，也可以在接近生理狀態的液體環境內工作，因此可以被用于生物樣本比如蛋白質、核酸、膜磷脂甚至是在生理過程中的活細胞的檢測。AFM作為一種高分辨率的形貌表征工具，可以很好地輔助生命科學研究中的定性、可視化分析，使得生命過程更加清晰直觀。盡管仍存在不完善之處，但未來若從改善針尖尺寸、開發雙探針甚至多探針系統[30]、提高掃描速度以及選用機械性能更加優良的探針材料等方面作出努力，相信AFM能更好地為我們所用，幫助我們更透徹地理解紛繁復雜的生命系統。

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2014-04-13

2015-04-29

國家重大科學計劃(973計劃)項目(2011CB933500)；國家自然科學基金資助項目(61127002)

鞠安(1994-)，女，江蘇南通人，在讀本科生。E-mail:chris.ju@qq.com

顧寧 E-mail:guning@seu.edu.cn

鞠安，蔣雯，許陽，等.原子力顯微鏡在生命科學領域研究中的應用進展[J].東南大學學報：醫學版，2015，34(5)：807-812．

Q-336

A

1671-6264(2015)05-0807-06

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.028