let-7e嵌合小鼠模型的建立和表型分析

孫迪，夏菲，楊燚，陳火，張進平

(蘇州大學 生物醫學研究院，江蘇 蘇州 215123)

·論 著·

let-7e嵌合小鼠模型的建立和表型分析

孫迪，夏菲，楊燚，陳火，張進平

(蘇州大學 生物醫學研究院，江蘇 蘇州 215123)

目的：探討微小RNA let-7e在淋巴細胞分化發育中的作用。方法：構建let-7e過表達嵌合小鼠模型，研究let-7e對淋巴組織中T細胞、B細胞、樹突狀細胞(DC)、髓系來源的抑制性細胞(MDSC)發育的影響；通過流式細胞儀檢測MDSC的細胞增殖和細胞凋亡，初步探討let-7e促使MDSC增多的機制。結果：嵌合小鼠模型檢測結果顯示：過表達let-7e后B細胞減少，漿細胞樣DC(pDC)、經典DC(cDC)增多，而T細胞及亞群比例沒有變化；同時，骨髓和脾臟中的MDSC比例升高，其凋亡水平明顯降低，但其增殖沒有改變。結論：let-7e參與了淋巴細胞的分化和發育；let-7e可以通過抑制細胞凋亡促進MDSC的增多。

骨髓嵌合模型； let-7e； 免疫表型； 髓系來源的抑制性細胞； 細胞凋亡

微小RNA(MicroRNAs,miR)是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在細胞發育和各種疾病中的作用和調控機制已經得到廣泛而深入的研究[1-3]。在免疫系統中，已有的研究表明，microRNA在造血干細胞、T細胞、B細胞、樹突狀細胞(DC)、自然殺傷(NK)細胞、粒細胞和巨噬細胞的發育、分化、生存及功能中均發揮重要作用[4-7]，從而參與了機體先天免疫和獲得性免疫。眾所周知，髓系來源的抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)在腫瘤和感染性疾病中對免疫應答起著很重要的負性調控作用，而MDSCs擴增是其發揮作用的顯著特征。2013年Li等研究發現miR-155和miR-21可以同時和分別調控功能性MDSCs的擴增[8]，提示microRNA參與了MDSC的擴增。

let-7e是最早一批被發現的微小let-7家族成員之一。最先由Lagos-Quintana等[9]在果蠅胚胎裂解產物中分離并確定其基因序列，同時也證明了let-7e在人HeLa細胞系、鼠和成年魚類中的表達。近年來一些研究表明，let-7e可以參與多個生物進程，包括胚胎發育、干細胞分化、腫瘤發生、炎癥反應等過程。在胚胎干細胞分化和神經細胞的分化過程中，let-7e是細胞分裂和增殖的調節因子[10]。在實驗性變態反應性腦脊髓炎模型中，體內沉默let-7e可導致Th1、Th17的減少以及炎癥的減弱，同時let-7e通過靶向IL-10促進炎癥的發生[11]，但是let-7e是否參與淋巴細胞的發育，至今少有報道。

為了研究let-7e對淋巴細胞分化發育的影響，我們首先建立let-7e過表達嵌合小鼠模型，通過流式細胞儀分析各淋巴細胞比例的變化，初步分析let-7e影響了哪種免疫細胞的發育，并進一步研究過表達let-7e引起的MDSCs數量增多的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1分子生物學試劑、抗體及引物 總RNA提取試劑、逆轉錄酶M-MLV(RNAase H-)[寶生物工程(大連)有限公司]，引物和Oligo dT(Invitrogen公司)，dNTP和Taq酶(TaKaRa公司)，Gr-1-PE/cy7、CD11b-FITC、B220-APC、CD4-APC、CD8-PE/cy7、CD11b-PE、CD11C-Percp/cy5.5、PDCA-1-APC、I-Ab-PE、CD11C-APC、Annexin Ⅴ-FITC等抗體(Biolegend公司)，5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)試劑盒(BD公司)，熒光定量試劑盒[羅氏診斷產品(上海)有限公司]。

1.1.2細胞培養相關試劑及材料細胞培養基 RPMI 1640、DMEM、L-谷氨酰氨(南京生興生物科技有限公司)，雙抗(氨卞青霉素鈉、硫酸鏈霉素，上海第四制藥廠)，胎牛血清/FBS(Gibco公司)，0.25%胰酶溶液+0.02% EDTA溶液(杭州吉諾生物醫藥技術有限公司)，1.8 ml凍存管(外旋)、移液管[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]，細胞培養板[康寧生命科學(吳江)有限公司]，PBS(1 L，NaCl 8 g、KCl 0.2 g、NaH2PO31.4 g、KH2PO30.27 g)，Ack(1 L，KHCO31.001 g、NH4Cl 8.024 g、EDTA 0.01 mmol·L-1)，5-氟尿嘧啶(5-FU)、氯喹、聚凝胺(Polybrene，Sigma公司)。

1.1.3細胞系、質粒及菌種 293T細胞系、宿主細菌stable-2、microRNA過表達質粒pMDH1-PGK-GFP以及病毒包裝質粒Pcl-eco為本研究院保存；按照質粒抽提試劑盒提取DNA，制成1 mg·ml-1的水溶液，-20 ℃保存備用。

1.1.4實驗儀器 流式細胞儀BD FACSCalibur、BD FACSCantoTMⅡ、BD FACSAriaⅢ(BD公司)；實時定量PCR儀(艾本德公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1293T細胞培養和小鼠骨髓細胞培養 在DMEM完全培養基中(含體積分數10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素)放置體積分數5%CO2、37 ℃的細胞培養箱中。

1.2.2骨髓嵌合小鼠的建立及逆轉錄病毒的制備 在無菌EP管中準備Ca2+DNA混合物(30 μg pMDH1-PGK-GFP-let-7e，PCL-ECO 10 μg，2 mol·L-1CaCl294 μl，加水至終體積為750 μl)，并與等體積的2倍HBS混勻，靜置5 min。在靜置時向細胞培養基中加入氯喹使終濃度為10 μmol·L-1。然后逐滴加入到預先鋪好的293T細胞中，8 h后換液。72 h后收集培養基，用0.22 μm的濾器過濾以得到含有病毒粒子的上清，然后以10 μl·(10 ml)-1的比例加入聚凝胺(20 mg·ml-1,終濃度20 μg·ml-1)。加入到經5-FU處理后采集的骨髓細胞中，2 500 r·min-1離心，27 ℃、1.5 h。離心結束后棄上清，更換新鮮培養基，并加入IL-3(工作濃度20 ng·ml-1)、IL-6(工作濃度50 ng·ml-1)、干細胞生長因子(SCF，工作濃度50 ng·ml-1)，繼續培養。24 h后以同樣的方式再次感染。收集感染過的骨髓細胞，并用PBS清洗兩遍，然后將細胞通過眼靜脈(200 μl·只-1)注射到輻照過的受體小鼠體內(以>8 Gy的劑量輻照受體小鼠)。

1.2.3實時定量PCR檢測let-7e表達 收集被檢測的細胞，用Trizol裂解細胞制備總RNA，用let-7e特異的逆轉錄引物(let-7e-RT)5′-CTC AAC TGG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TCA GTT GAG ACT ATA CA-3′制備let-7e特異的cDNA。然后用let-7e特異性的定量PCR引物進行擴增：上游引物5′-CTC AAC TGG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TCA GTT GAG ACT ATA CA-3′,下游引物5′-CTC AAC TGG TGT CGT GGA-3′。部分RNA用多聚胸腺嘧啶逆轉后，用GAPDH引物做PCR作為內參對照。GAPDH上游引物5′-AGA AAC CTG CCA AGT ATG ATG ACA-3，下游引物5′-GGA AGA GTG GGA GTT GCT GTT G-3′。應用熒光定量試劑進行擴增，擴增條件：94℃ 5 min變性，94 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s，40個循環。

1.2.4let-7e基因擴增 以B6小鼠基因組DNA為模板，以Pfx多聚酶(Invitrogen公司)進行PCR擴增，PCR產物長度為500 bp。let-7e基因擴增上游引物：5′-CTC GAG ACT GAA TTC CTG GGT TCC TTG-3′；下游引物：5′-GAA TTC TAG AGA CAT TGG CAT AAG AGA C-3′。

1.3 統計學處理

每個實驗獨立重復3次及以上，實驗數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗分析,P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 let-7e過表達嵌合小鼠的構建

根據www.mirbase.org網站收錄的小鼠mmu-let-7e的成熟片段和前體miRNA序列，我們將成熟片段的前后各150 bp左右的序列擴增到載體上。應用PubMed網站對比到其相應的DNA序列，設計PCR引物。將擴增的PCR產物用XhoⅠ/EcoRⅠ(NEB)進行雙酶切，同時將載體pMDH1-PGK-GFP用同樣的酶進行雙酶切。連接、測序正確之后，應用配制的鈣轉染試劑將質粒pMDH1-PGK-GFP-let-7e轉染到293T細胞中，8 h后換新鮮培養液，繼續培養40 h后，收集293T細胞，并同時收集未轉染的293T細胞作對照，用qRT-PCR檢測let-7e。

首先用特異的RT引物(let-7e-RT)進行逆轉錄，然后用特異的引物(let-7e-F、let-7e-R)進行實時定量PCR擴增。所得結果如圖1。

aP<0.01

圖1 實時定量PCR檢測pMDH-GFP-let-7e質粒中let-7e的表達Fig 1 Detection of let-7e in 293T cells transfected with pMDH-GFP-let-7e

在確定此質粒可以成功表達let-7e的前提下，我們開始建立骨髓嵌合小鼠模型。在骨髓嵌合模型建立6周后，取let-7e過表達嵌合小鼠的骨髓、脾臟、胸腺，制備單個細胞懸液，并進行FACS分析。GFP+細胞為let-7e過表達細胞，GFP-細胞為正常細胞。實驗顯示let-7e過表達細胞，即GFP+細胞比例大約占50%(圖2)，說明我們的模型是成功的。

圖2 通過檢測GFP確定嵌合小鼠的嵌合效率

Fig 2 Detection of GFP in chimeric mouse model

2.2 淋巴細胞的表型分析

取let-7e過表達嵌合小鼠的骨髓、脾臟、胸腺，制備單個細胞懸液，用相應的抗體染色，并進行流式細胞術分析。結果顯示，脾臟和胸腺中CD4+T、CD8+T細胞等各亞群的比例和GFP-組比較沒有明顯變化(圖3A、B)。這說明let-7e對T細胞的發育分化沒有影響；在骨髓和脾臟中，對B細胞分析的結果顯示，GFP+細胞群中的B細胞總數(B220+)比例明顯下降，通過B亞群比例分析發現B亞群明顯減少(圖4A～D)，這說明了B細胞的發育受阻。

圖3 let-7e嵌合小鼠中T細胞表型分析 A.胸腺中GFP+與GFP-的T細胞及亞群的比例； B.脾臟中GFP+與GFP-的T細胞及亞群的比例

Fig 3 Phenotype analysis of T cell subset in let-7e chimeric mice

對DC的分析結果顯示：脾臟中GFP+細胞群中漿細胞樣DC(pDC)的比例與GFP-細胞群相比沒有顯著變化(圖5A、B)；骨髓中GFP+細胞群中pDC的比例與GFP-細胞群相比明顯升高(圖6A、B)，從3%左右上升到10%。我們只檢測了脾臟中經典DC(cDC)比例的變化，結果顯示脾臟中GFP+細胞群中cDC比例較GFP-細胞群中有明顯升高(圖7A、B)，達到2倍以上，這說明let-7e可能參與調控了DC的分化發育過程。

我們同時也檢測了骨髓和脾臟中MDSCs的比例變化，結果發現GFP+細胞群中Gr-1+CD11b+MDSCs的比例明顯高于GFP-細胞群的比例(圖8A～C)，根據統計結果MDSCs的比例升高了近2倍，結合MDSCs本身的作用，可能說明let-7e在MDSCs的增多和功能方面起著重要作用。

2.3 let-7e對MDSCs凋亡的抑制

為了說明骨髓和脾臟中GFP+細胞群中MDSCs的比例明顯上升的原因(我們猜測let-7e可能是通過促進MDSCs的增殖或者是降低MDSCs自身的凋亡來實現這一結果的)，我們首先在12 h向嵌合小鼠腹腔注射1 mg的Brdu，隨后處死小鼠，取小鼠的骨髓和脾臟細胞制備單細胞懸浮液。對MDSCs的表面分子進行染色，然后對細胞進行胞內Brdu染色，流式細胞儀檢測統計數據，結果發現GFP+和GFP-細胞群中MDSCs的增殖沒有顯著變化(圖9)。同時，我們也對MDSCs的凋亡水平進行分析，流式細胞儀檢測結果顯示GFP+細胞群中MDSCs的凋亡跟GFP-相比明顯降低(圖10A、B)。

bP<0.05; cP<0.001

圖4 let-7e嵌合小鼠中B細胞表型分析 A.骨髓中GFP+與GFP-的B220+B細胞的比例； B.骨髓中GFP+與GFP-中B220+B細胞的比例統計； C.脾臟中GFP+與GFP-的B220+B細胞的比例； D.脾臟中GFP+與GFP-中B220+B細胞比例統計(n>15)

Fig 4 Phenotype analysis of B cell in let-7e chimeric mice

dP>0.05

圖5 let-7e嵌合小鼠脾臟中pDC細胞表型分析 A.脾臟中GFP+與GFP-的pDC比例； B.脾臟中GFP+與GFP-中pDC比例統計(n>15)

Fig 5 Phenotype analysis of spleen pDCs in let-7e chimeric mice

3 討 論

為了研究let-7e在淋巴細胞發育中的作用，我們構建了嵌合小鼠模型。首先，我們檢測了骨髓、脾臟、胸腺中相應細胞群的比例變化，結果顯示除了T細胞及其亞群沒有發生變化外，其余類型細胞群都有變化。說明了let-7e在淋巴細胞發育中的重要性。本實驗中

let-7e通過何種方式影響B細胞發育還有待進一步研究。我們同時發現了let-7e過表達后骨髓中pDC的增高和cDC的細胞群在脾臟中的增高，提示我們let-7e可能參與了促進DC分化的過程。在本研究中我們應用let-7e過表達嵌合小鼠模型研究發現，MDSC的比例明顯升高，骨髓中MDSCs的比例可以升高3倍，脾臟中MDSCs的比例由3%可以升高5倍至16%，說

bP<0.05

圖6 let-7e嵌合小鼠骨髓中pDC細胞表型分析 A.骨髓中GFP+與GFP-的pDC比例； B.骨髓中GFP+與GFP-中pDC比例統計(n>15)

Fig 6 Phenotype analysis of BM pDCs in let-7e chimeric mice

aP<0.01

圖7 let-7e嵌合小鼠脾臟中cDC細胞表型分析 A.脾臟中GFP+與GFP-的cDC比例； B.脾臟中GFP+與GFP-中cDC比例統計(n>15)

Fig 7 Phenotype analysis of spleen cDCs in let-7e chimeric mice

明MDSCs增多較為明顯，let-7e參與了MDSCs增多的過程。有很多報道說明microRNA與MDSCs相關，Mir-29a可以有效地促進髓樣細胞的增殖，它可以有效地促進細胞周期中的細胞從G1期轉向G2/S階段，同時增加細胞存活能力[12]；對研究最為廣泛的mir-146，Baltimore等將其敲除后發現,骨髓和脾臟中MDSCs明顯累積，并伴隨著NF-κB的活化[13]。我們知道MDSCs不僅可以抑制T細胞的功能和增殖，而且還可以被炎癥因子活化，啟動下游JAK-STAT等信號通路，通過分泌抑制性功能因子達到調控炎癥和腫瘤生長的作用。MDSCs的顯著特點是在病理條件下顯著擴增[14]。但究竟是何種因素導致MDSCs的擴增還不是很清楚。

cP<0.001

圖8 let-7e嵌合小鼠中MDSCs細胞表型分析 A.骨髓和脾臟中GFP+與GFP-的MDSCs比例； B.骨髓中GFP+與GFP-的MDSCs比例統計； C.脾臟中GFP+與GFP-的MDSCs比例統計(n>15)

Fig 8 Phenotype analysis of MDSCs in let-7e chimeric mice

dP>0.05

圖9 let-7e對嵌合小鼠MDSCs的增殖的影響Fig 9 Influence on MDSCs proliferation in let-7e chimeric mice

越來越多的報道表明不同條件下MDSCs擴增的機制不同。比如對造血干細胞和對前體細胞分化的調控，對成熟細胞分化的抑制，造成了MDSCs的自然增多；同時也可以通過調控MDSCs本身的狀態來改變，比如通過促進增殖或者抑制凋亡使MDSCs比例升高，通過延長其細胞壽命，使MDSCs群體呈現增多的狀態，甚至還可以通過表達更多的趨化受體，依據趨化因子的不同，轉移到不同的地方或組織，從而顯示MDSCs的增多。

事實上，以上MDSCs擴增過程中都有microRNA的參與。在本研究中，MDSCs在骨髓和脾臟中明顯增多，這種增多是由于凋亡的減少實現的，而不是由于增殖能力的提高。僅從細胞凋亡的角度來說，let-7e是如何減少MDSCs的凋亡的還不得而知。根據之前在PC12細胞系中的報道[15]，是否let-7e也調控了MDSCs細胞中凋亡下游效應分子如半胱氨酸蛋白酶家族(caspase)，還需要在以后的實驗中加以驗證。總之，我們的實驗解釋了let-7e對淋巴細胞分化發育的影響，我們初步的實驗結果證明，其中MDSC增多是由其凋亡減少造成的，給MDSCs擴增機制的研究提供了新的思路和方向。

aP<0.01； bP<0.05

圖10 let-7e嵌合小鼠MDSCs的凋亡分析 A.骨髓和脾臟中GFP+細胞群及GFP-細胞群中MDSCs的凋亡表型分析； B.骨髓中GFP+與GFP-中MDSCs凋亡比例統計分析(n>15)

Fig 10 Analysis of MDSCs apoptosis in let-7e chimeric mice

在本研究中，過表達let-7e影響了不同細胞群，如B細胞、DC、MDSC的比例在中樞免疫器官以及外周中的變化。說明let-7e在固有免疫、適應性免疫、腫瘤免疫及炎癥中應起著很重要的作用。本研究為進一步研究let-7e在相關細胞群中的作用提供了方向和基礎。

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Establishment of let-7e bone marrow chimeric mouse model and the analysis of immune phenotypes

SUN Di，XIA Fei，YANG Yi，CHEN Huo，ZHANG Jin-ping

(InstitutesofBiologyandMedicalSciences，SoochowUniversity，Suzhou215123，China)

Objective: To investigate the function of let-7e on the development of immunocytes. Methods: To study the function of let-7e on the development of immunocytes， the let-7e over-expression chimeric mouse were firstly established by retrovirus infection. Thereafter， the proliferation and apoptosis were evaluated by FACS. Results: Chimeric mouse model was successfully established and confirmed by FACS and qRT-PCR.FACS analysis showed that over-expressed let-7e decreased the percentage of B220+cells both in BM and spleen cells， increased the percentages of pDCs， cDCs，and MDSCs， but did not change the percentage of T cells and its subsets. Further experiments suggested that over-expressed let-7e increased the percentages of MDSCs by inhibiting the apoptosis of MDSCs， but did not alter their proliferation. Conclusion: let-7e is involved in lymphocyte differentiation and development; let-7e over-expression can increase the number of MDSCs by inhibiting apoptosis．

chimeric model； let-7e； immune phenotype； myeloid-derived suppressor cells； apoptosis

2015-05-03

2015-05-28

國家自然科學基金面上項目(31270939，81471526)；組織器官區域免疫特性與疾病重大研究計劃培育項目(91442110)；江蘇省自然科學基金面上項目(BK2012617)；江蘇省高校自然科學研究重大項目(13KJA310004)

孫迪(1988-)，男，安徽阜陽人，在讀碩士研究生。E-mail：adiok0903@126.com

張進平 E-mail：j_pzhang@suda.edu.cn

孫迪，夏菲，楊燚，等.let-7e嵌合小鼠模型的建立和表型分析[J].東南大學學報：醫學版，2015，34(5)：696-704．

R392.9; R-33

A

1671-6264(2015)05-0696-09

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.004