血管緊張素Ⅱ灌注在脂質肝損傷中的作用研究

吳娛，張洋，胡澤波，劉亮，王桂花，魯薦，馬坤嶺

(東南大學附屬中大醫院 腎內科，江蘇 南京 210009)

·論 著·

血管緊張素Ⅱ灌注在脂質肝損傷中的作用研究

吳娛，張洋，胡澤波，劉亮，王桂花，魯薦，馬坤嶺

(東南大學附屬中大醫院 腎內科，江蘇 南京 210009)

目的：通過制備血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)灌注模型，觀察AngⅡ在脂質肝損傷中的作用及其可能的機制。方法：將C57BL/6小鼠隨機分為對照組、AngⅡ灌注組及AngⅡ灌注加AngⅡ 1型受體(AT1R)基因敲除組。采用HE、菲律賓、油紅0染色以及胞內膽固醇定量測定法觀察肝細胞內脂質沉積情況；免疫組化、蛋白質印跡法檢測低密度脂蛋白受體(LDLR)、固醇調節元件結合蛋白2(SREBP-2)及其裂解激活蛋白(SCAP)表達水平。結果：AngⅡ刺激增加C57BL/6小鼠肝細胞內脂質沉積，且上調LDLR、SREBP-2和SCAP的表達。而AT1R基因敲除組C57BL/6小鼠肝細胞內脂質沉積明顯減少，LDLR通路的相關蛋白表達也顯著下調。結論：AngⅡ通過AT1R誘導LDLR負反饋調節失調，進而增加膽固醇內流、肝細胞內脂質過度沉積，介導脂質肝損傷的發生。

血管緊張素Ⅱ灌注； 低密度脂蛋白受體； 脂質肝損傷

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種以無過量飲酒史，肝實質細胞脂肪性變和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征。其病程包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎和脂肪性肝硬化，最終可能演變為肝硬化[1]和肝癌[2]。近年來，全世界NAFLD的患病率平均為20%[3]，已成為危害人類健康的一種常見的慢性肝臟疾病。目前NAFLD的發病機制尚未明確。近來研究發現，應用血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(angiotensinⅡ receptor blocker，ARB)可延緩NAFLD的進展[4]，如替米沙坦能夠抑制肝內脂質沉積，且在正常飲食的小鼠模型中，替米沙坦也能減弱胰島素的抵抗狀態[5]，從而改善肝臟的脂肪變性[6]，提示腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)激活可能參與了脂質肝損傷的發生、發展。我們在既往的研究中已經證實，血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)可通過上調低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)的表達，導致細胞攝入膽固醇增加，造成人近端腎小管上皮細胞(human renal proximal tubular epithelial，HK-2)[7]以及系膜細胞[8]內脂質過度沉積，泡沫細胞形成。研究還發現RAS激活與脂代謝紊亂在疾病進展過程中存在交互作用[7]。本研究中，我們通過制備AngⅡ灌注模型，觀察AngⅡ在脂質肝損傷中的作用及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 模型制備及分組

將24只8周齡的清潔級健康雄性C57BL/6小鼠喂以普通飲食，并隨機均分為對照組、AngⅡ灌注組(AngⅡ皮下持續泵入)以及AngⅡ 1型受體(AT1R)基因敲除組(AngⅡ+AT1R-/-)。持續飼養4周后處死小鼠，并收集血液標本以及肝臟組織進行相關指標的檢測。

1.2 試劑

AngⅡ、焦碳酸二乙酯(DEPC)、蘇木素、膽固醇酶酯、膽固醇氧化酶、辣根過氧化物酶、4-氨基安替比林、苯酚、磷酸氫二甲緩沖液、膽酸鈉、酒石酸鈉、福林酚、1，2-丙二醇(美國Sigma)，預染蛋白標記、十二烷基硫酸鈉(南京生興生物技術有限公司)，菲律賓熒光染色試劑盒(上海杰美基因醫藥科技有限公司)、免疫組化試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司)、全蛋白提取試劑盒、蛋白測定試劑盒(南京鷺飛生物技術有限公司)，ECL發光劑(英國GE)，LDLR、固醇調節元件結合蛋白2(sterol regulatory element-binding protein，SREBP-2)、固醇調節元件結合蛋白裂解激活蛋白(sterol regulatory element-binding protein cleavage activating protein，SCAP)及β-actin抗體(美國Santa Cruz)，辣根過氧化物酶標記的二抗(上海基因科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1肝臟病理學檢查 肝臟組織經10%甲醛固定、石蠟包埋，切成3 μm薄片后行HE染色，光鏡下觀察肝臟組織病理學改變。

1.3.2菲律賓染色 將石蠟包埋后的蠟塊切成3 μm薄片后，按菲律賓染色操作步驟說明書進行。

1.3.3胞內膽固醇定量測定 取大小約5 mm×5 mm的新鮮肝臟組織，加入1 ml氯仿與甲醇混合物(2∶1)，采用超聲波細胞儀破碎肝臟組織。收集上清液，真空干燥后用化學酶促法定量檢測細胞總膽固醇(TC)、游離膽固醇(FC)的含量，膽固醇酯(CE)=TC-FC。向試管中沉淀部分加入1 mol·L-1氫氯化鈉，孵育12 h后，用Folin-酚試劑法測定總蛋白含量，分別計算膽固醇與細胞內總蛋白的比值，分析其相對含量。

1.3.4免疫組化 石蠟切片脫蠟水化，微波修復抗原，采用SP法免疫組化試劑盒，檢測指標包括LDLR、SCAP和SREBP-2(1∶100稀釋)，DAB顯色2～5 min，顯微鏡下觀察，控制著色時間，蘇木素復染，所有操作按照說明書進行。

1.3.5蛋白質印跡 取液氮保存的肝組織，加適量裂解液后勻漿、離心，取上清液檢測蛋白濃度。取等量組織蛋白樣本變性后SDS-PAGE凝膠電泳，轉入PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，然后分別與特異性LDLR、SCAP和SREBP-2抗體(1∶200)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，再與辣根過氧化物酶標記的二抗室溫下孵育1 h，洗膜，ECL化學發光法曝光。以β-肌動蛋白(1∶500)作為內參，測定蛋白相對表達水平。

1.4 統計學處理

計量資料數據以均數±標準誤表示，多組間比較采用單因素方差分析。使用SPSS 16.0統計軟件進行統計分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 AngⅡ促進肝細胞內脂質沉積

HE以及菲律賓染色結果顯示，與對照組相比，AngⅡ組小鼠肝細胞內有泡沫細胞形成以及大量脂質沉積，但AT1R敲除的小鼠肝細胞中脂質明顯減少，膽固醇定量測定結果與此一致，見圖1、2。

圖1 AngⅡ促進肝細胞內脂質沉積 A.HE染色×400； B.菲律賓染色×200

Fig 1 AngⅡ promotes lipid accumulation in hepatic cells

a 與對照組比較，P<0.05； b 與AngⅡ組比較，P<0.05

圖2 膽固醇定量測定結果

Fig 2 The results of quantitative intracellular cholesterol analysis

2.2 AngⅡ誘導體內LDLR負反饋調節途徑紊亂

免疫組化結果顯示，LDLR、SCAP和SREBP-2在AngⅡ灌注組小鼠中表達明顯增加，而AT1R敲除后的小鼠，其表達明顯減少，蛋白質印跡結果也與此一致，見圖3。

3 討 論

早在2002年就有研究者發現，在正常肝細胞內可檢測到AT1R[9]，而有關RAS與肝臟疾病的研究也越來越多。RAS能促進肝臟炎癥[4]、氧化應激[10]等反應，從而加速肝臟脂肪變性，最后導致NAFLD的發生。近年來研究發現，應用RAS阻斷劑可促進小的、對胰島素更敏感的脂肪細胞形成，從而改善脂肪代謝紊亂[11]，但就RAS激活后對肝細胞內脂代謝紊亂的調節作用研究甚少。

a 與對照組相比，P<0.05； b 與AngⅡ組相比，P<0.05

圖3 AngⅡ誘導肝內LDLR負反饋調節途徑紊亂 A.免疫組化×400； B、C.蛋白印跡法結果及灰度值定量

Fig 3 AngⅡ disrupts LDLR feedback regulation in the liver

在NAFLD的患者體內，維持肝細胞膽固醇穩態的多個環節遭到破壞，膽固醇內流增加、外流減少以及腸肝循環發生障礙，導致肝細胞內膽固醇沉積和脂肪肝的形成。而肝細胞內膽固醇代謝受多個核因子調節。SREBP-2是調節膽固醇代謝的主要核因子之一，在細胞內膽固醇缺乏時，SREBP-2被激活，從內質網轉位到高爾基體，經蛋白酶水解，形成活性的SREBP-2，進入核內，進而上調LDLR等靶基因的轉錄，增加膽固醇的合成和攝取[12]。既往有研究發現，干擾RAS系統相關蛋白的表達會阻止由高脂飲食誘導的肥胖的發生[13]，此外，將AT1R基因敲除也能減少肝臟發生脂肪變性[14]。我們的研究團隊也發現，AngⅡ刺激HK-2細胞會通過破壞LDLR負反饋調節途徑，誘導脂質的過度沉積[7]。本研究中，與對照組相比，AngⅡ灌注組的小鼠肝細胞內脂質沉積明顯增加，同時LDLR、SCAP和SREBP-2的基因與蛋白水平都顯著上調，但敲除AT1R基因后，脂質沉積明顯減少，表明AngⅡ破壞了肝細胞內LDLR負反饋調節途徑，增加胞內膽固醇的攝入。Lu等[15]研究發現，AngⅡ能增加LDL氧化，氧化型LDL被巨噬細胞攝取，從而促進動脈粥樣硬化的形成。研究還發現應用RAS抑制劑能改善腎臟足細胞對脂的代謝，從而延緩腎小球疾病的發展[16-18]。我們首次證實了AngⅡ可通過破壞LDLR信號途徑誘導肝細胞對膽固醇的過度攝取，且敲除AT1R基因后能明顯抑制脂質對肝細胞的損傷。

綜上所述，我們通過AngⅡ灌注模型研究證實，AngⅡ能上調LDLR的表達，從而導致肝細胞內攝取膽固醇增加，胞內脂質過度沉積，進一步通過敲除AngⅡ的作用受體AT1R基因，表明了RAS激活能通過促進肝細胞內脂代謝紊亂而加速脂質肝損傷。本研究為脂質肝損傷疾病如NAFLD的治療提供了新的思路。

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The role of angiotensinⅡ perfusion in fatty liver injury

WU Yu，ZHANG Yang，HU Ze-bo，LIU Liang，WANG Gui-hua，LU Jian，MA Kun-ling

(DepartmentofNephrology，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective: To investigate the possible effects of angiotensinⅡ(AngⅡ) on fatty liver injury and its possible mechanism via the construction of AngⅡ perfusion model. Methods: C57BL/6 mice were randomly divided into three groups: the control group， the AngⅡ group and the AngⅡ with angiotensinⅡ type 1 receptor(AT1R) gene knockout group. Lipid accumulation was examined with haematoxylin-eosin(HE) staining， Oil red O staining， Filipin staining， and a quantitative assay of intracellular cholesterol. The protein expressions of low-density lipoprotein receptor(LDLR)， sterol regulatory element-binding protein 2(SREBP-2) and its cleavage activating protein(SCAP) were determined by immunochemical staining and Western blotting. Results: AngⅡ stimulation increased lipid deposition in livers of C57BL/6 mice， which was associated with increased protein expression of LDLR，SCAP， and SREBP-2. However， lipid accumulation in hepatic cells of AT1R gene knockout C57BL/6 mice dropped; moreover， the expression of LDLR pathway related protein significantly dropped. Conclusion: AngⅡ disrupts LDLR feed-back regulation via its receptor AT1R to increase cholesterol uptake and induce intracellular lipid accumulation， contributing to the development of liver injury．

angiotensinⅡ perfusion； low density lipoprotein receptor； fatty liver injury

2015-03-23

2015-05-04

國家自然科學基金資助項目(81470957，81170792)；江蘇省自然科學基金資助項目(BK20141343)

吳娛(1988-)，女，江蘇江陰人，在讀碩士研究生。E-mail：wu_yu_126@126.com

馬坤嶺 E-mail：klma05@163.com

吳娛，張洋，胡澤波，等.血管緊張素Ⅱ灌注在脂質肝損傷中的作用研究[J].東南大學學報：醫學版，2015，34(5)：740-744．

R575.5

A

1671-6264(2015)05-0740-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.012