神經激肽-1受體在GERD模型豚鼠咳嗽反射敏感性中的作用

劉娜，董榕，林勇，賴克方

(1.東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學 生理藥理學系，江蘇 南京 210009； 3.東南大學附屬胸科醫院 呼吸內科，江蘇 南京 210029； 4.廣州醫科大學 附屬第一醫院，廣東 廣州 510000)

·論 著·

神經激肽-1受體在GERD模型豚鼠咳嗽反射敏感性中的作用

劉娜1，董榕2，林勇3，賴克方4

(1.東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學 生理藥理學系，江蘇 南京 210009； 3.東南大學附屬胸科醫院 呼吸內科，江蘇 南京 210029； 4.廣州醫科大學 附屬第一醫院，廣東 廣州 510000)

目的：探究胃食管反流性豚鼠模型肺組織神經激肽-1受體(NK-1R)與咳嗽反射敏感性(CRS)之間的關系。方法：分組建模后評估豚鼠CRS，免疫組化染色檢測肺組織NK-1R的表達。結果：模型組CRS增加，肺內NK-1R表達增加(108.48±25.71vs38.54±17.62，P<0.05)。肉毒毒素-A注射后較模型組咳嗽次數減少(23.33±7.53vs51.17±10.19，P<0.05)，NK-1R表達減少(21.59±13.45vs108.48±25.71，P<0.05)，潛伏時間未見改變(11.76±3.29vs8.24±4.73，P>0.05)。結論：胃食管反流性豚鼠氣道CRS增高可能與肺組織中NK-1R表達增加有關。

胃食管反流性疾病； 神經激肽-1受體； 咳嗽反射敏感性； 肉毒毒素-A； 豚鼠

胃食管反流性疾病(gastroesophageal reflux disease，GERD)除伴有食管癥狀外，亦和咳嗽、哮喘、肺炎[1]等呼吸系統疾病相關。現多認為胃內反流物刺激食管下端感受器，經食管-支氣管反射致肺內P物質(substance P，SP)等神經源性炎癥因子表達增加，產生神經源性炎癥損傷氣道，從而更易產生呼吸系統癥狀。SP主要與神經激肽-1受體(neurokinin-1 receptor，NK-1R)結合發揮作用。A型肉毒毒素(botulinum toxin-A，BTX-A)可阻斷神經源性炎癥，且作用持久[2]。GERD豚鼠模型中氣道咳嗽反射敏感性(cough reflex sensitivity，CRS)的變化及肺內NK-1R在其增高過程中的作用尚不清楚。

本實驗擬構建豚鼠GERD模型，利用檸檬酸霧化評估造模前后CRS改變；在使用或不使用BTX-A下檢測肺內NK-1R的表達，探討神經源性炎癥因子受體NK-1R與GERD豚鼠氣道CRS之間的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性Hartly豚鼠，體重250～300 g，購自東南大學醫學院實驗動物中心，在安靜、溫暖(18～25 ℃)、避強光、晝夜光照節律(明暗周期為14/10 h)下飼養。給予足量豚鼠飼料、飲食和適量青菜，保持墊料清潔干燥。

1.2 藥品與儀器

主要儀器：RM 6240 B型四道生理信號采集處理系統、聲能咳嗽記錄儀(成都儀器廠)，402 AI超聲霧化器(江蘇魚躍醫療設備公司)，5 F胃管、輸液裝置、脫色搖床(江蘇省金壇市醫療儀器廠)，冰凍切片機(Leica)，光學顯微鏡(Olympus)。

主要藥品與試劑：含0.5%胃蛋白酶(Sigma)的稀釋鹽酸(pH=1)：1 000 ml雙蒸水中滴入濃鹽酸，搖勻后調pH至1.0，加入5 g胃蛋白酶混勻4 ℃保存；兔抗NK-1R多克隆抗體、一水合檸檬酸、多聚甲醛(Sigma)，BTX-A(蘭州生物制品研究所)，氯胺酮注射液(福建古田藥業)，SP-9001試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，烏拉坦(上海國藥集團)，PBS粉末(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1檸檬酸引咳 實驗使用檸檬酸霧化激發豚鼠咳嗽，通過記錄咳嗽次數及咳嗽潛伏時間(從開始噴霧到第1聲咳嗽之間的時間)，評估豚鼠氣道CRS。

將聲能咳嗽記錄儀與RM 6240 B型四道生理信號采集處理系統連接，即可通過計算機自動生成豚鼠的咳嗽波形。豚鼠置于聲能咳嗽記錄儀中記錄正常呼吸波10 s后，用超聲霧化器(電壓220 V，最大霧化率≥3 ml·min-1)將17.5%的檸檬酸霧化，通過管道向咳嗽記錄儀內噴霧15 s[3]，記錄豚鼠20 min內的咳嗽次數及咳嗽潛伏時間。

根據引咳數據剔除咳嗽反射不敏感或過敏感的動物，剔除標準[3]： 5 min內咳嗽次數≤10次或≥50次，和(或)噴霧后咳嗽潛伏時間≤10 s或≥120 s。選取CRS正常的30只豚鼠分組實驗。

1.3.2動物分組與模型建立 將CRS正常的豚鼠隨機分為：(1) 模型組[4]：禁食后4 h氯胺酮(50 mg·kg-1)注射輕度麻醉后取仰臥位，自口腔插入5 F胃管至食管中、下段(7～8 cm)，觀察30 s無異常后，以8滴·min-1的速度灌注含0.5%胃蛋白酶的稀釋鹽酸15～20 min·d-1，連續15 d；(2) 空白組：飼養環境下15 d；(3) 生理鹽水(NS)組：方法同模型組，換用NS食管內灌注；(4) 模型加BTX-A組：同模型組，第6天食管灌注12 h后氣道內注射BTX-A(2 U·kg-1)，12 h后繼續食管內灌注；(5) 模型加NS組：方法同模型加BTX-A組，改用NS(0.2 ml·kg-1)氣道內注射。以上豚鼠第14天食管操作后12 h再次檸檬酸引咳；第15天食管操作后4 h行心臟灌流取肺組織。

1.3.3氣道內藥物注射 (1) 按氯胺酮75 mg·kg-1加0.5 ml烏拉坦腹腔內注射，麻醉后固定；(2) 消毒頸部皮膚后剪開(2～3 cm)，逐層分離至氣管暴露；(3) 注入藥物，停針30 s后拔出，消毒并逐層縫合。

1.3.4心臟灌流固定及組織取材 25%烏拉坦(1 g·kg-1)腹腔注射后打開胸腔暴露心臟，左心室穿刺后NS快速灌注，直至右心耳流出的液體清亮(約400 ml)，再灌注4%多聚甲醛至僵硬為止(約500 ml，總時間90～120 min)。取肺組織置于4 ℃ 4%多聚甲醛中后固定6 h，轉入30%蔗糖溶液中3 d。

1.3.5肺內NK-1R的免疫組化染色實驗及陽性反應物計數 取肺組織塊予OCT包埋后冰凍切片機中制冷10 min，-20 ℃連續切片(片厚40 μm)，經0.3% H2O2去離子水室溫孵育30 min、山羊血清封閉液室溫1 h后，直接轉入兔抗NK-1R多克隆抗體稀釋液(1∶400)中4 ℃冰箱過夜。取出復溫1 h后滴加生物素標記的山羊抗兔二抗工作液室溫1 h，再滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液室溫1 h，最后二氨基聯苯胺(DAB)室溫下鏡控顯色并貼片。以上每一步驟前均經0.01 mol·L-1PBS漂洗10 min 3遍。晾干后梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。每只動物測定5張切片，每張切片3個視野，使用專業軟件分析隨機視野下的平均光密度值。

空白對照組以PBS緩沖液代替一抗，其它染色步驟相同。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 造模期間動物一般情況

造模過程中食管內酸性溶液灌注的豚鼠第1～3天均出現進食減少，體重略下降，后進食水逐漸恢復，體重漸增長。灌注7～8 d后，模型組豚鼠食管灌注時易出現不同程度的咳嗽，對照組未見明顯上述改變。

2.2 檸檬酸引咳記錄的咳嗽波形

17.5%檸檬酸噴霧15 s可引起豚鼠咳嗽，在透明裝置中觀察到豚鼠胸廓起伏、前腳伸出、頸部伸向前、抓耳撓腮和擺頭等特征性動作。人工聯合儀器同時記錄，結果以能聽到的咳嗽聲音并伴隨特征性咳嗽動作計算，利用軟件描計出咳嗽波形，見圖1。

圖1 咳嗽聲能記錄儀轉化后的咳嗽波形

Fig 1 Cough waves were recordered by sound energy converter

2.3 咳嗽次數及潛伏時間

咳嗽次數：造模前組間未見明顯差異(P>0.05)，造模后模型組較空白組及NS組咳嗽次數增多(P<0.05)，氣道內BTX-A注射后與模型組相比咳嗽次數下降(P<0.05)，見表1。

組 別咳嗽次數造模前造模后空白組22.50±8.1229.50±13.40NS組24.00±9.1726.80±9.83模型組29.83±13.6051.17±10.19ab模型+BTX-A組29.00±6.4523.33±7.53c模型+NS組26.33±9.6961.17±16.27ab

a 與NS組和空白組比較，P<0.05； b 與造模前模型組比較，P<0.05； c 與模型組比較，P<0.05

咳嗽潛伏時間：造模前組間未見明顯差異(P>0.05)，造模后模型組較對照組縮短(P<0.05)。BTX-A氣道注射后咳嗽潛伏時間較模型組有增加，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

組 別咳嗽潛伏時間/s造模前造模后空白組51.50±12.3738.17±9.91NS組49.10±18.9731.92±4.78模型組54.80±25.048.24±4.73ab模型+BTX-A組41.10±17.8011.76±3.29模型+NS組53.00±33.123.88±1.88ab

a 與NS組和空白組比較，P<0.05； b 與造模前模型組比較，P<0.05

結果表明：多次食管內酸性溶液灌注構建的GERD模型可使豚鼠CRS增高，表現為咳嗽次數增多及潛伏時間縮短；氣道內注射BTX-A阻斷神經源性因子釋放后可減少檸檬酸引咳的咳嗽次數，但潛伏時間未見明顯改變。

2.4 免疫組化染色法檢測肺組織NK-1R的表達

空白組及NS組豚鼠肺組織切片鏡下可見少量NK-1R免疫陽性反應物分布表達，呈棕黃色顆粒狀，主要分布于氣道支氣管及血管周圍，以胞漿染色為主。模型組及模型加NS組豚鼠氣道、血管及肺泡周圍肺內可見大量NK-1R陽性物質表達，呈深棕黃色圓形或橢圓形顆粒，相較于對照組其表達明顯增多(圖2A～

E)。測量平均光密度值表明，模型組NK-1R的平均光密度值明顯高于空白組(108.48±25.71vs38.54±17.62，P<0.05)及NS組(108.48±25.71vs43.51±19.43，P<0.05)；氣道內使用BTX-A后NK-1R的表達較模型組明顯減少，平均光密度值降低(21.59±13.45vs108.48±25.71，P<0.05)。見圖3。

A～E依次為空白組、NS組、模型組、模型+BTX-A組、模型+NS組

圖2 各組豚鼠造模后肺組織NK-1R免疫陽性物的表達(箭頭所示)(LSAB法，DAB染色×200)Fig 2 Expression of neurokinin-1 receptor in lung by immunohistochemical staining(LSAB，DAB×200)

圖3 造模后肺組織NK-1R免疫陽性物表達的平均光密度值

Fig 3 The IOD of neurokinin-1 receptor expression in lung

以上PBS空白組實驗鏡下未見陽性物質表達。

結果表明，GERD豚鼠模型肺組織中NK-1R表達增加，氣道內注射BTX-A后可使其表達下降。

3 討 論

神經源性炎癥因子SP及其受體NK-1R參與多種疾病發病過程[5]，GERD即可通過食管-支氣管反射導致肺內神經源性炎癥，產生一系列呼吸系統癥狀。實驗中我們采用食管內多次酸性溶液灌注的方法建立豚鼠GERD模型[4]，實驗室前期及Liu等[6]通過一系列方法驗證了該模型肺組織中神經源性炎癥的存在。人體試驗亦發現GERD患者支氣管肺泡灌洗液中SP、神經激肽A(NKA)等神經源性炎癥因子表達增高[7]。神經源性炎癥的產生和持續存在可能是GERD呼吸系統癥狀產生的根源。

建模過程中發現，酸性溶液灌注數天后豚鼠更易出現刺激性咳嗽。檸檬酸檢測氣道CRS時發現，食管酸灌注可使外界刺激物激發咳嗽的濃度閾值下降，提示食管酸化可能導致氣道CRS的增加。有學者認為反流導致的神經源性炎癥可使機體呈現內臟高敏狀態，此病理過程涉及SP和NK-1R表達的增加[8]，食管高敏感性亦可能是反流疾病中食管癥狀產生的主要原因[9]。

本實驗檢測NK-1R的表達后發現，GERD豚鼠肺組織中NK-1R表達增加。神經源性炎癥因子SP主要與NK-1R結合發揮作用。實驗室前期實驗證實此模型中SP的表達亦存在明顯升高，上調的NK-1R可結合更多的SP，產生更明顯的神經源性炎癥表現，從而加重氣道結構損傷，使感覺神經纖維末梢感受器裸露，更易接收外界刺激信號導致咳嗽反射的激活。哮喘[10]及煙霧刺激模型[11]亦存在與表達增加的NK-1R有關的氣道敏感性增高，并可通過NK-1R拮抗劑阻斷[12]。

顯微鏡下可見增多的NK-1R主要分布于細支氣管、終末細支氣管及血管周圍，文獻亦報道SP及NK-1R主要表達于小氣道及血管周圍[13]，但實驗過程中由于取材及切片時未能保留完整的主支氣管及段支氣管結構，故未能驗證大氣道周圍是否存在NK-1R的表達改變。下一步實驗可考慮單獨取材大氣道，檢測其分布及表達情況。

神經源性炎癥在GERD豚鼠氣道CRS增高中起到重要作用。BTX-A可通過阻斷神經源性炎癥因子的釋放阻斷神經源性炎癥[2]，實驗中被用來治療過敏性鼻炎[14]及慢性頑固性咳嗽[15]。本次實驗使用BTX-A阻斷神經源性炎癥，再使用檸檬酸測量豚鼠氣道CRS，發現咳嗽次數下降，但潛伏時間未見明顯改變，與實驗最初設想部分不符。分析原因可能為：氣道內的咳嗽感受器分為快適應感受器(rapidly adapting mechanoreceptors，RARs)和C-纖維感受器兩類。RARs主要感受氣道機械刺激；C-纖維屬于無髓鞘感覺神經，主要接受氣道化學性傷害刺激，以神經源性炎癥因子SP、NKA等為遞質；二者在氣道中均可激發咳嗽。BTX-A阻斷了C纖維的遞質釋放，但對RARs的阻斷作用并不明顯。BTX-A對咳嗽傳入沖動的部分阻斷導致咳嗽潛伏時間未見明顯改變，但咳嗽次數減少。同時檢測BTX-A氣道注射后肺組織NK-1R的表達，發現其表達下降，進一步提示氣道神經源性炎癥對肺組織NK-1R及氣道CRS的影響，其中NK-1R對氣道CRS的增高可能有間接作用。但本實驗對BTX-A阻斷神經源性炎癥因子的釋放缺少驗證性實驗，擬在進一步實驗中梯度注射BTX-A后定量檢測SP等神經源性因子的表達，以明確是否存在一定的量-效關系。

綜上所述，GERD引起的氣道神經源性炎癥與氣道CRS增高的發生機制密切相關，其機制可能涉及肺內NK-1R表達的增加，即通過上調突觸后受體的表達，加劇肺內神經源性炎癥表現，使氣道CRS增加。

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The role of neurokinin-1 receptor in gastroesophageal reflux model of guinea pigs with the increase of cough reflex sensitivity

LIU Na1，DONG Rong2，LIN Yong3，LAI Ke-fang4

(1.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China； 2.DepartmentofPhysiologyandPharmacology，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China； 3.DepartmentofRespiratory，AffiliatedNanjingChestHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210029，China； 4.AffiliatedFirstHospital，GuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou510000，China)

Objective: To explore the relationships between cough reflex sensitivity and the neurokinin-1 receptor expression in lung in the gastroesophageal reflux model. Methods: We built the model and measured cough reflex sensitivity， observed neurokinin-1 receptor in lung by immunohistochemical staining. Results: The cough reflex sensitivity and the numbers of neurokinin-1 receptor-immunoreactive substances increased(108.48±25.71vs38.54±17.62，P<0.05)in the model group. Injected botulinum toxin-A into airway， the cough times dropped(23.33±7.53vs51.17±10.19，P<0.05)， and the number of neurokinin-1 receptor also lowered(21.59±13.45vs108.48±25.71，P<0.05)，but the cough latency was not significantly different(11.76±3.29vs8.24±4.73，P>0.05) compared to the model group. Conclusion: GERD increases the cough reflex sensitivity， and neurokinin-1 receptor in lung may play an important role in it．

gastroesophageal reflux disease； neurokinin-1 receptor； cough reflex sensitivity； botulinum toxin-A； guinea pigs

2015-04-01

2015-05-04

廣州呼吸疾病國家重點實驗室開放項目(2007DA780154F0905)

劉娜(1988-)，女，湖北神農架人，在讀碩士研究生。E-mail:liuna860@163.com

董榕 E-mail：dongrongshengli@163.com

劉娜，董榕，林勇，等.速激肽-1受體在GERD模型豚鼠咳嗽反射敏感性中的作用[J].東南大學學報：醫學版，2015，34(5)：731-735．

R-33

A

1671-6264(2015)05-0731-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.010