堿性成纖維細胞生長因子預處理對大鼠腦缺血/再灌注損傷的神經保護作用

何丹，楊勢赫，金志成，于月，楊雪薇，儲霞，呂海芹

(東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009)

·論 著·

堿性成纖維細胞生長因子預處理對大鼠腦缺血/再灌注損傷的神經保護作用

何丹，楊勢赫，金志成，于月，楊雪薇，儲霞，呂海芹

(東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009)

目的：探討堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)預處理對腦缺血再灌注損傷(IR)的神經保護作用及其可能的機制。方法：90只雄性SD大鼠隨機分成假手術組(A組)、腦缺血/再灌注對照組(B組)及bFGF預處理組(C組)。在制備腦缺血/再灌注模型前向C組大鼠側腦室注射50 μg·ml-1的bFGF 5 μl，向A組和B組大鼠側腦室注射等體積的生理鹽水，注射2 h后建立腦缺血/再灌注動物模型。分別于術后1、3、7 d進行改良的神經功能評分(mNSS)，通過TTC染色計算梗死體積；術后1 d采用甲苯胺藍染色和TUNEL染色技術觀察缺血/再灌注區域神經細胞受損程度和凋亡情況。結果：與B組相比，C組mNSS降低，梗死體積縮小；細胞損傷程度減輕，TUNEL陽性細胞減少。結論：bFGF預處理對大鼠缺血再灌注損傷有神經保護作用，其機制可能與抑制缺血受損區域的神經細胞凋亡有關。

堿性成纖維細胞生長因子； 腦缺血/再灌注損傷； 細胞凋亡； 神經保護； 大鼠

缺血性腦血管病(Ischemic cerebral vescular disease，ICVD)是人類的常見病和多發病，致殘率和病死率很高，嚴重威脅人類的健康[1]。近年來我國腦血管病發病率呈逐年升高的趨勢[2]。大腦主要供血動脈內血栓形成或栓塞而導致局部血液循環中斷、腦組織缺血、神經細胞形態改變及功能障礙是急性缺血性腦卒中(AIS)最常見的發病原因[3]。缺血組織的血流供應恢復后，由恢復血供而引起原有缺血性病變的進一步加重稱為腦缺血/再灌注損傷。腦缺血/再灌注損傷會導致大量的神經細胞死亡，包括急性的細胞壞死和繼發性的細胞凋亡[4-5]。壞死是不可逆的過程，而凋亡是可逆的，抑制或減少腦缺血區域神經細胞的凋亡可以挽救缺血半暗帶，從而縮小梗死灶，恢復神經功能[4，6]。

堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth fctor，bFGF)是一種具有多種生物學活性的神經營養因子，為含有154個氨基酸的單鏈多肽。在生理情況下，腦內僅有少量的bFGF表達；在病理條件下如缺血后，腦組織內bFGF及其受體表達上調，對神經元有保護作用[7]。本研究選擇bFGF作為保護劑，采用線栓法建立大鼠腦部局灶性缺血/再灌注損傷模型，探討bFGF預處理對腦缺血/再灌注損傷的神經保護作用，從而為腦缺血/再灌注損傷的防治和功能恢復提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑和儀器 重組大鼠bFGF(PeproTech公司)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)粉末(Biosharp公司)，甲苯胺藍尼染色液(上海碧云天生物科技有限公司)，原位末端轉移酶標記(TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒(Roche公司)，光學顯微鏡(日本Olympus公司)，CM1900 Leica冰凍切片機(德國 Leica公司)，單臂數字式腦立體定位儀(上海第二軍醫大學)。

1.1.2實驗動物及分組 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠90只，體重250～300 g(南京軍區總醫院實驗動物中心提供)，隨機分為假手術組(A組)、腦缺血/再灌注對照組(B組)及bFGF預處理組(C組)，每組30只。大鼠放在東南大學醫學院實驗動物中心飼養，動物飼養條件：室溫(22±2)℃、濕度50%～60%，自然晝夜規律、通風良好，自由攝食、飲水。

1.2 方法

1.2.1側腦室注射 在制備腦缺血/再灌注模型前，向C組大鼠的左側側腦室注射濃度為50 μg·ml-1bFGF的溶液5 μl，向B組及A組大鼠的左側側腦室注射等體積的無菌生理鹽水。側腦室注射方法是：大鼠經10%水合氯醛0.3 ml·(100 g)-1腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于腦立體定位儀上，常規手術操作，沿頭皮正中做縱向2 cm切口，分離皮下組織，剝離骨膜，暴露冠狀縫及矢狀縫，以前囟點為中心定好坐標，參照Paxinos-Watson大鼠圖譜確定側腦室的注射靶點坐標為左側旁開0.8 mm、向后囟方向1.5 mm、深度4 mm。用牙科鉆鉆開顱骨暴露硬腦膜，用微量注射器將藥液緩慢注入，0.5 μl·min-1，注射完畢后留針10 min，緩慢撤針，縫合傷口。

1.2.2腦缺血/再灌注模型的制備及鑒定 大鼠經側腦室注射給藥2 h后，參照Longa等[8]描述的方法，采用單側大腦中動脈線栓法制備大鼠局灶性腦缺血/再灌注模型，具體方法如下：大鼠用10%水合氯醛0.3 ml·(100 g)-1麻醉后仰臥位固定，常規手術操作，做頸部正中切口，依次分離暴露左側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)，分別掛線，結扎CCA的近心端和ECA，并用動脈夾暫時夾閉ICA。用顯微剪在CCA距分叉近心端3 mm處剪一45°小切口，將栓線球端插入，并用手術線輕輕結扎。松開ICA的動脈夾，將栓線順勢插入ICA約18 mm，至有阻力感時停止。MCA阻斷2 h后完全拔出線栓，縫合皮膚。A組動物除不對CCA造口和插入線栓外，其余操作步驟同B組。手術后觀察大鼠的體征，出現以下表現者提示模型制作成功：(1) Horner征；(2) 將鼠尾提起，右前肢屈曲，不能伸直；行走時無法直線行走，出現轉圈現象。A組僅出現Horner征，無其它表現。

1.2.3改良的神經功能缺失評分(mNSS) 分別在手術后1、3、7 d觀察大鼠的神經行為學表現，并根據Chen等[9]描述的方法對大鼠進行神經功能缺失評分。神經功能評分依據其損傷程度分為0～18分。在評分標準中，1分表示不能完成某項測試或者缺乏某種反射，0.5分表示某一項測試的癥狀適中，介于0分和1分之間；分數越高表示損傷越嚴重。

1.2.5組織冰凍切片的制備 大鼠經10%水合氯醛0.3 ml·(100 g)-1腹腔注射麻醉后，于左心室升主動脈插管快速灌注生理鹽水500 ml，然后持續灌注含有4%多聚甲醛的預冷磷酸鹽緩沖液400 ml。開顱取腦，腦組織經4%多聚甲醛溶液中固定24 h后再經20%和30%蔗糖梯度脫水。將脫水后的腦組織在冰凍切片機上切成20 μm厚的切片，-20 ℃保存備用。

1.2.6甲苯胺藍染色 將-20 ℃保存的腦組織切片自然晾干，以去離子水(dH2O)沖洗2 min；然后滴加甲苯胺藍染液，于室溫染色20 min；以dH2O洗滌2次，每次數秒；再滴加95%乙醇分化5 s；然后以70%乙醇和95%乙醇梯度脫水2次，每次2 min；再用二甲苯透明，中性樹膠封片；置于光鏡下觀察攝片。

1.2.7TUNEL法觀察神經細胞凋亡情況 冰凍切片晾干后用PBS漂洗3次；用蛋白酶K工作液室溫孵育30 min ；PBS漂洗3次；按TUNEL檢測試劑盒說明書進行操作，DAB顯色。經PBS漂洗和70%、80%、90%、95%、100%乙醇梯度脫水后，二甲苯透明5 min，中性樹膠封片，光鏡觀察。每張切片隨機選取5個不同視野，在高倍鏡(400倍)下觀察并計數凋亡細胞。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 mNSS結果

術前2 h通過側腦室灌注方法分別予A組和B組5 μl無菌生理鹽水、C組5 μl含有50 μg·ml-1bFGF的藥液灌注。在術后1、3和7 d分別對上述各組大鼠進行mNSS，結果見圖1。A組動物未出現神經功能損傷癥狀，mNSS均為0分。B組和C組動物均出現缺血側同側Horner征及對側神經功能缺損癥狀，且在術后1 d損傷最嚴重，術后3 d和7 d有自發恢復的趨勢。與B組相比，C組大鼠在術后不同時間點的mNSS均明顯降低(P<0.05)。

圖1 各組大鼠改良的神經功能缺失評分

Fig 1 The results of neurological evaluation by the modified neurological severity score of each group

2.2 各組TTC染色結果

術后1、3和7 d分別從上述各組中隨機選取6只大鼠進行TTC染色。肉眼觀察染色結果顯示：A組沒有出現明顯的梗死灶，組織呈現鮮紅色；B組和C組大鼠在所觀察的3個時間點均出現明顯的蒼白色梗死灶，梗死部位主要累及大腦額葉、頂葉和紋狀體區，術后第1天梗死灶面積最大，隨后有縮小的趨勢(圖2A)。經過Image J圖像分析處理，計算各個梗死灶的體積比發現：與B組相比，C組大鼠在各個觀察時間點的梗死灶體積均顯著縮小(P<0.05，圖2B)。

2.3 神經細胞的形態學改變

術后1 d從上述各組中隨機選出6只大鼠進行甲苯胺藍染色，光學顯微鏡觀察。結果顯示：尼氏體呈紫色、細胞核呈藍色。A組未見神經元損傷，細胞結構對稱、排列規則、具有正常細胞形態特征；B組的損傷側大腦皮質、紋狀體和海馬區均出現大面積的祌經元壞死和凋亡，受損區神經元排列紊亂，細胞核固縮、深染，海馬CA1區大量神經元丟失。與B組相比，C組缺血區雖然也出現神經細胞核固縮和排列錯亂，但是神經細胞變性損傷范圍明顯減小，病變程度明顯減輕(圖3)。

2.4 TUNEL染色結果

術后1 d從各組大中選取6只鼠進行TUNEL染色，光鏡下觀察。A組幾乎無TUNEL陽性細胞的表達；但B組和C組的缺血側皮質和紋狀體中可見大量的TUNEL陽性細胞表達，表現為細胞的體積變小、變形，細胞質濃縮，呈棕色染色(圖4)。與B組相比，C組的缺血側皮質和紋狀體區TUNEL陽性細胞數量均明顯減少(P<0.05，表1)。

3 討 論

腦缺血/再灌注損傷是指腦組織缺血一定時間重新恢復血液供應后，原有的缺血性腦組織損害反而加重。隨著血管內介入治療的廣泛開展和早期溶栓藥物[10]的普遍應用，缺血性腦梗死組織恢復灌注率越來越高。腦缺血/再灌注損傷對腦損害的機制非常復雜，可能由于再灌注過程中血管壁通透性增加，血腦屏障被破壞，使血液或水分滲出，加重腦組織水腫；另外在再灌注早期由于氧供的恢復導致大量的活性氧(ROS)產生及其引發的細胞膜、細胞器發生脂質過氧化反應、細胞內大量鈣離子積累促進興奮性氨基酸釋放而導致細胞毒性損傷及加速神經元的壞死和凋亡，從而使病情進一步加重[9，11]。因此，如何有效防治腦缺血/再灌注損傷一直是臨床研究的熱點。大腦中動脈供血范圍的腦缺血是臨床最常見的腦缺血性疾病類型，利用血管內線栓法阻塞大腦中動脈一段時間是運用最廣泛的建立腦缺血/再灌注損傷動物模型的方法[8]。我們利用線栓法暫時性(2 h)阻斷SD大鼠大腦中動脈的血供，成功制作了局灶性腦缺血/再灌注損傷動物模型。通過行為學方法檢測發現腦缺血大鼠神經功能受損顯著，組織形態學檢測證實有明顯的梗死灶出現，缺血側大腦皮質、紋狀體中出現大量的細胞凋亡，神經元損傷嚴重。

bFGF是中樞神經系統內廣泛存在的一種具有多種生物活性的神經營養因子，主要通過與細胞膜表面特異性受體FGFRs結合發揮作用，對維護中樞神經系統正常功能具有重要作用[12-13]。已有研究表明，中樞神經系統的內源性bFGF在腦組織缺血損傷后表達上調，具有神經修復作用[6]。動物實驗表明，腦缺血后通過側腦室或蛛網膜下池注射外源性bFGF可以抑制海馬錐體細胞的壞死和凋亡，對腦缺血有治療作用[13-16]。在本研究中，我們在建立局灶性腦缺血/再灌注損傷動物模型前通過側腦室注射方式給動物用bFGF進行預防性治療，注射2 h后再行造模手術。在術后1、3、7 d進行mNSS，TTC染色計算梗死體積。結果發現術后1 d大鼠神經功能損傷和腦梗死癥狀均表現最嚴重，之后逐漸有減輕的趨勢。說明大鼠對腦缺血/再灌注損傷有自我修復的能力，但這種損傷的自我修復是有限的，無法達到完全康復。經過與對照組比較，我們發現bFGF預處理組大鼠在術后各個觀察時間點的神經功能損傷的癥狀、梗死灶的面積和神經細胞損傷程度均比未經bFGF處理的缺血組輕。這一研究結果表明：bFGF預處理可以有效地發揮神經保護作用，有助于損傷神經組織的修復。在我們的前期預實驗中，我們曾分別于腦缺血前和缺血后予大鼠側腦室注射bFGF，并對兩種處理方式進行了比較，發現bFGF預處理方式由于藥物在腦缺血前提前進入腦室，對缺血損傷的保護效果更加顯著。

圖2 bFGF預處理對大鼠腦梗死灶體積的影響 A.大鼠腦組織TTC染色； B.B組和C組腦梗死體積的統計結果

Fig 2 The effects of bFGF pretreatment on the infarct size of the rat brains A.Infarct areas of the rat brains of each group indicated by TTC staining； B.The calculated average infarct volumes of group B and group C

凋亡是多細胞有機體為調控機體發育、維護內環境穩定，由基因控制的細胞主動死亡過程。大量研究表明，細胞凋亡與腦缺血/再灌注損傷關系密切，是腦缺血再灌注損傷后神經元死亡的重要方式。Bcl-2基因家族和caspase基因家族在細胞凋亡過程中發揮重要的作用[17]。腦缺血再灌注損傷組織在早期會產生一系列級聯反應，包括興奮性谷氨酸釋放、Ca2+超載、線粒體損傷以及炎癥反應等，這些都會導致大量的細胞凋亡。凋亡是一個可逆的過程，通過及時的治療可以讓更多的細胞存活。Wang等[18]發現，bFGF通過PI3K/Akt和ERK1/2途徑減少細胞凋亡，促進神經功能恢復。周海紅等[19]在體外細胞實驗中也發現，bFGF能抑制神經細胞的凋亡。另有研究表明，腹腔內注射外源性bFGF能明顯減少新生鼠缺血腦組織神經細胞的凋亡，促進神經修復，對受損神經細胞起到有效的保護作用[20]。我們通過甲苯胺藍尼氏染色和TUNEL染色觀察術后1 d缺血側神經細胞受損程度和凋亡情況。實驗結果顯示，bFGF預處理能抑制損傷側皮質和紋狀體缺血半暗帶的細胞凋亡，減輕神經細胞變性損傷程度。這一結果提示bFGF預處理的神經保護作用可能與抑制受損神經細胞的凋亡有關。本實驗為臨床藥物預處理防治腦缺血性損傷提供了實驗依據，但bFGF的不同給藥時間和劑量對腦缺血大鼠的神經保護作用是否存在差異、bFGF抑制神經細胞凋亡的具體分子機制，以及是否還通過其它作用機制發揮其神經保護作用，尚待進一步研究。

圖3 大鼠腦組織甲苯胺藍染色結果(×40) 內嵌圖為放大200倍的觀察結果

Fig 3 Neuropathologic changes of the rat brain tissue examined bytoluidine blue staining(×40) The small images are enlarged 200 times

圖4 術后1 d各組大鼠皮質和紋狀體TUNEL染色結果(×200) 內嵌圖為放大400倍的觀察結果

Fig 4 Neuron apoptosis within the cortex and straitum on the operated side of the brains in each group which was determined by TUNEL staining (×200) 1 d after operation Small images are enlarged 400 times

組別nTUNEL陽性細胞數缺血側皮層缺血側紋狀體A組600B組6100.7±4.970.3±5.0C組685.6±4.6a55.5±3.4a

a 與B組相比，P<0.05

[1] PRZYBYLOWSKI C J，DING D，STARKE M，et al.Evolution of endovascular mechanical thrombectomy for acute ischemic stroke[J].World J Clin Cases，2014，2(11):614-622．

[2] 馮光坤，牛建花，朱海英，等.中青年與老年腦梗死患者的病因及危險因素研究[J].中國全科醫學，2012，15(17)：1940-1942．

[3] DIRNAGL U，IADECOLA C，MOSKOWITZ M A.Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view[J].Trends Neurosci，1999， 22:391-397．

[4] YUAN J.Neuroprotective strategies targeting apoptotic and necrotic cell death for stroke[J].Apoptosis,2009，14(4)：469-477．

[5] LI Z，PANG L，FANG F，et al.Resveratrol attenuates brain damage in a rat model of focal cerebral ischemia via up-regulation of hippocampal Bcl-2[J].Brain Res,2012，1450:116-124．

[6] WANG J，WANG P，LI S，et al.Mdivi-1 prevents apoptosis induced by ischemia-reperfusion injury in primary hippocampal cells via inhibition of reactive oxygen species-activated mitochondrial pathway[J].J Stroke Cerebrovasc Dis，2014， 23(6)：1491-1499．

[7] LIN T N，TE J，LEE M，et al.Induction of basic fibroblast growth factor (bFGF) expression following focal cerebral ischemia[J].Brain Res Mol Brain Res,1997，49(1-2)：255-265．

[8] LONGA E Z，WEINSTEIN P R，CARLSON S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20:84-91．

[9] CHEN J，LI Y，WANG L，et al.Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats[J].Stroke，2001，32(4)：1005-1011．

[10] 程改存，陸鵬，吳麗珍，等.降纖藥治療急性缺血性腦血管病的臨床效果觀察[J].現代醫學，2012，40(3):322-324．

[11] SIMARD J M，KENT T A，CHEN M，et al.Brain oedema in focal ischaemia:molecular pathophysiology and theoretical implications[J].Lancet Neurol，2007，6(3)：258-268．

[12] SARKAKI A，RAIEIRAD M，HOSSINI S E，et al.Improvement in memory and brain long-term potentiation deicits due to permanent hypoperfusion/ischemia by grape seed extract in rats[J].Iran J Basic Med Sci，2013，16(9)：1004-1010．

[13] LI Q，STEPHENSON D.Postischemic administration of basic fibroblast growth factor improves sensorimotor function and reduces infarct size following permanent focal cerebral ischemia in the rat[J].Exp Neurol,2002，177(2)：531-537．

[14] REUSS B，von BOHLEN U，HALBACH O.Fibroblast growth factors and their receptors in the central nervous system[J].Cell Tissue Res，2003，313(2)：139-157．

[15] KAWAMATA T，ALEXIS N E，DIETRICH W D，et al.Intracisternal basic fibroblast growth factor(bFGF) enhances behavioral recovery following focal cerebral infarction in the rat[J].J Cereb Blood Flow Metab,1996，16(4)：542-547．

[16] LI Q，STEPHENSON D.Postischemic administration of basic fibroblast growth factor improves sensorimotor function and reduces infarct size following permanent focal cerebral ischemia in the rat[J].Exp Neurol,2002，177(2)：531-537．

[17] LI J，YUAN J.Caspases in apoptosis and beyond[J].Oncogene，2008， 27(48)：6194-6206．

[18] WANG Z，ZHANG H，XU X，et al.bFGF inhibits ER stress induced by ischemic oxidative injury via activation of the PI3K/Akt and ERK1/2 pathways[J].Toxicol Lett,2012，212(2)：137-146．

[19] 周海紅，劉運林，劉軍，等.外源性堿性成纖維細胞生長因子對放射誘導神經干細胞凋亡的抑制效應[J].中國組織工程研究與臨床康復，2009，13(23)：4467-4470.

[20] 尹曉娟，劉冬云，羅分平，等.堿性成纖維細胞生長因子對缺氧缺血性腦損傷新生鼠骨形態發生蛋白4及其mRNA表達的影響[J].中華兒科雜志, 2009，47(11)：856-861．

Neuroprotective effect of basic fibroblast growth factor pretreatment on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats

HE Dan，YANG Shi-he，JIN Zhi-cheng，YU Yue，YANG Xue-wei，CHU Xia，Lü Hai-qin

(SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective:To explore the neuroprotective effect and the underlying mechanism of basic fibroblast growth factor(bFGF) pretreatment on cerebral ischemia-reperfusion injury. Methods: A total of 90 healthy male Sprague-Dawley(SD) rats were randomly assigned into three groups: group A (sham-operated group)，group B(ischemia-reperfusion control group)，and group C(bFGF pretreatment group). 5 μl of bFGF (50 mg·ml-1in saline) was administered to the animals of group C by intraventricular injection and an equal amount was administered to the animals of groups A and B by intraventricular injection.2 hours later， ischemia-reperfusion animal model was constructed.The loss of neurological function was assessed by the modified neurological severity score(mNSS) and the infarct volume was determined by TTC staining 1，3，and 7 days after MCAO. Toluidine blue staining(TBS) was performed for gross histological changes and TUNEL staining was performed for detection of cell apoptosis 1 day after MCAO. Results: In animals of group C，the mNSS score and the infarct volume both dropped; the extent of cell damage was alleviated and the number of TUNEL positive cells dropped compared with group B. Conclusion: bFGF pretreatment has a neuroprotective effect on cerebral ischemia-reperfusion injury in MCAO model of rat. The mechanism of pretreated bFGF in neuroprotection might be related to the inhibition of apoptosis of neurons within the ischemic region．

basic fibroblast growth fctor； ischemia-reperfusion injury； apoptosis； neuroprotection； rats

2015-04-01

2015-05-01

教育部留學回國人員科研啟動基金資助項目(6824000002)；東南大學科技基金資助項目(9224000008)

何丹(1989-)，男，安徽池州人，在讀碩士研究生。E-mail:220122826@seu.edu.cn

呂海芹 E-mail:haiqinlu@seu.edu.cn

何丹，楊勢赫，金志成，等.堿性成纖維細胞生長因子預處理對大鼠腦缺血/再灌注損傷的神經保護作用[J].東南大學學報：醫學版，2015，34(5)：714-720．

R-33

1671-6264(2015)05-0714-07

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.007