DHA逆轉(zhuǎn)卵巢癌細胞A2780/T紫杉醇耐藥的機制研究

吳翌楠，王蘇立，王迎春，趙麗君，盧錦，王金華，2

(1.南京醫(yī)科大學附屬江蘇省腫瘤醫(yī)院 婦瘤科，江蘇 南京 210009； 2.解放軍南京軍區(qū)總醫(yī)院 普外科，江蘇 南京 210002)

·論 著·

DHA逆轉(zhuǎn)卵巢癌細胞A2780/T紫杉醇耐藥的機制研究

吳翌楠1，王蘇立1，王迎春1，趙麗君1，盧錦1，王金華1，2

(1.南京醫(yī)科大學附屬江蘇省腫瘤醫(yī)院 婦瘤科，江蘇 南京 210009； 2.解放軍南京軍區(qū)總醫(yī)院 普外科，江蘇 南京 210002)

目的：探討二十二碳六烯酸(DHA)對卵巢癌耐藥細胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用及其機制。方法：利用MTT評估細胞對紫杉醇耐藥性的改變，羅單明實驗驗證細胞的藥物外排能力，流式細胞儀檢測細胞周期的分布，實時定量PCR及蛋白質(zhì)印跡檢測多藥耐藥蛋白1(MDR1)的mRNA水平、耐藥相關(guān)蛋白及通路蛋白的蛋白水平。結(jié)果：DHA作用48 h后A2780/T對紫杉醇的半數(shù)抑制率(IC50)下降(P<0.05)，且羅丹明在胞內(nèi)的含量增加，呈劑量依賴性(P<0.05)。同時紫杉醇與DHA聯(lián)合使用可以改變細胞周期的分布，GO/G1期的細胞百分比上升(P<0.05)，P-糖蛋白(P-gp)及其他MDR相關(guān)蛋白的表達下降，NF-κB及磷酸化p38 MAPK表達下降，而p38 MAPK未見明顯變化。結(jié)論：DHA可以通過改變細胞周期分布，抑制P-gp及MDR相關(guān)蛋白的功能和表達，逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥細胞的耐藥性，同時該機制還可能與抑制NF-κB通路、抑制p38 MAPK的磷酸化有關(guān)。

二十二碳六烯酸； 卵巢癌； 紫杉醇耐藥； P-糖蛋白； 核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號通路； p38 促分裂素源活化蛋白激酶

卵巢癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，死亡率居首位。由于卵巢解剖位置隱匿，早期癥狀不明顯，70%的卵巢癌患者發(fā)病時已屬晚期。卵巢癌傳統(tǒng)的治療方法主要是手術(shù)及化療，但晚期患者往往不適合直接手術(shù)治療，常以化療為主[1]。在眾多化療藥物中，紫杉醇因其對順鉑耐藥及多數(shù)未控的卵巢癌效果顯著而成為一線化療藥物之一；然而紫杉醇的廣泛應(yīng)用又導致了其耐藥的出現(xiàn)，約85%的患者最終出現(xiàn)了腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以致治療失敗[2]。因此紫杉醇耐藥成為了臨床醫(yī)師治療卵巢癌過程中的最大障礙。流行病學及臨床學研究均表明，二十二碳六烯酸(DHA)可以增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[3]。這也意味著，DHA可以與化療藥協(xié)同作用，逆轉(zhuǎn)細胞的耐藥性，增加化療藥物對腫瘤細胞的殺傷力。然而目前DHA在卵巢癌中的耐藥逆轉(zhuǎn)作用幾乎沒有報道。本研究旨在通過比較DHA作用前后卵巢癌耐藥細胞A2780/T在RNA水平及蛋白水平等多方面的變化，探討DHA對卵巢癌紫杉醇耐藥細胞A2780/T的耐藥逆轉(zhuǎn)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫杉醇(太極制藥有限公司)，羅丹明(Rh123)、DHA(Sigma公司)，P-gp抗體(Abcam 生物技術(shù)公司)，抗β-肌動蛋白、人磷酸甘油酸脫氫酶(GADPH)、多重耐藥相關(guān)蛋白1/2(multidrug resistance-related protein 1/2，MRP 1/2)、乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、肺癌耐藥相關(guān)蛋白(lung resistance-related protein，LRP)、HRP標記的二抗(horseradish peroxidase-linked)(南京Enogene生物技術(shù)有限公司)，抗p38促分裂素源活化蛋白激酶(p38 MAPK)、磷酸化p38 MAPK(pp38 MAPK)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB,cell signal technology)、細胞凋亡試劑盒和細胞周期試劑盒(BIO-BOX生物技術(shù)公司)，RIPA裂解液、BCA試劑盒和Trizol試劑RNA提取試劑盒(Beyotime生物技術(shù)研究所)，Taq DNA聚合酶、dNTPs和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)

1.2.1.1培養(yǎng)條件 A2780細胞培養(yǎng)于RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含體積分數(shù)10%胎牛血清和體積分數(shù)1%雙抗)。A2780/T細胞在含有Taxol的完全培養(yǎng)基中。細胞培養(yǎng)在37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.1.2細胞株 人卵巢癌細胞株A2780由Enogene生物技術(shù)有限公司贈送，在前期實驗中實驗組成員成功誘導出了穩(wěn)定的紫杉醇耐藥株A2780/Taxol(A2780/T)。

1.2.2MTT檢測細胞增殖抑制實驗

將1×105個對數(shù)生長期細胞接種于96孔板中，每株細胞設(shè)立3個復(fù)孔，只加培養(yǎng)基不加細胞為空白對照孔。24 h后棄掉培養(yǎng)基，加入不同濃度的藥物，共10個梯度。于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2的飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后棄上清，每孔加入MTT 15 μl(5 mg·ml-1)及無血清DMEM 200 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出后2 000 r·min-1離心10 min，棄上清，每孔加200 μl DMSO振蕩10 min，用酶標分析儀在570 nm波長處測定各孔吸光值(A值)。實驗重復(fù)3次，取平均值。以藥物濃度為橫坐標，以A值為縱坐標繪制細胞增殖抑制曲線。相同條件下實驗重復(fù)3次。根據(jù)細胞生長的抑制率，計算半數(shù)抑制率(IC50)。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=對照組IC50/實驗組IC50(對照組細胞為A2780/T，實驗組細胞為DHA預(yù)處理后的A2780/T)。

1.2.3Rh123實驗

將5×105個對數(shù)生長期細胞接種于6孔板中培養(yǎng)過夜。A2780/T細胞中加入3 μmol·L-1Taxol和不同濃度的DHA，于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，后直接加入5 μmol·L-1Rh123培養(yǎng)2 h，吸去細胞上清后用PBS洗3遍，1 h內(nèi)采用流式細胞儀進行分析和免疫熒光顯微鏡進行觀察。

1.2.4細胞周期檢測

處理過的細胞用PBS洗3遍后，用含體積分數(shù)70%的無水酒精4 ℃孵育過夜，加入PBS重懸以洗去殘余的酒精，然后加入核糖核酸酶A(RNase A)100 μl避光孵育30 min，并加入400 μl PI染色，上流式細胞儀檢測。

1.2.5實時定量PCR(RT-PCR)分析

1.2.5.1總RNA的提取 取對數(shù)生長期細胞，用Trizol試劑盒提取總RNA，按照提取試劑的試劑盒說明書進行操作。

1.2.5.2逆轉(zhuǎn)錄 RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟進行操作。反應(yīng)條件為逆轉(zhuǎn)錄50 ℃ 30 min和激活PCR 95 ℃ 15 min。cDNA置于-20 ℃保存。

1.2.5.3RT-PCR RT-PCR擴增反應(yīng)體系為20 μl，SYBR 10 μl，Rox Dye 0.4 μl，cDNA模板1 μl，GADPH正義反義引物各0.5 μl，多藥耐藥蛋白1(MDR1)正義反義引物各0.5 μl，無RNA水解酶(RNase free)去離子水7.6 μl。MDR1的引物序列：正向為5′-CCCAGGAGC

CCATCCTGT-3′，反向為5′-CCCGGCTGTTGTCTCCATA-3′；GADPH：正向為5′-AATCCCATCACCATCTTCCA-3，反向為5′-TGGACTCCACGACGTACTCA-3′。PCR循壞為：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 10 s，共40個循環(huán)。最后用StepOnePlusTMRT-PCR系統(tǒng)進行檢測分析。每次試驗每種細胞設(shè)置3個復(fù)孔，mRNA水平用ΔCT平均值來表示，按照2-ΔΔCT法計算基因的相對表達含量。

1.2.6免疫印跡

收集的細胞加入含有10 mmol·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF) RIPA裂解液冰浴，30 min后用細胞刮刀將細胞刮下，收集后4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min。吸出上清液，BCA法進行蛋白定量。按照50 μg蛋白的量加入到10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜后TBST洗滌，每次10 min，共3次，二抗(1∶20 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌，每次10 min，共4次，洗滌后加入化學發(fā)光液，最后通過GelPro gel分析軟件拍照。

1.2.7統(tǒng)計學處理

每個實驗獨立重復(fù)3次及以上，計算數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標準差表示，實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行t檢驗和卡方檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 DHA對卵巢癌耐藥細胞的細胞毒性

為了排除DHA細胞毒作用對實驗結(jié)果的干擾，我們用MTT法評估DHA對A2780及A2780/T細胞生存率的影響，以選出最適濃度。檢測結(jié)果(圖1)顯示，隨著DHA濃度的增加，A2780(圖1B)及A2780/T(圖1A)細胞存活率下降。當DHA濃度分別低于64 μmol·L-1及296 μmol·L-1時，細胞毒作用可以忽略不計(細胞存活率不低于90%)。因此我們分別選擇64 μmol·L-1和296 μmol·L-1作為A2780及A2780/T細胞中DHA的作用濃度。

圖1 DHA對A2780/T及A2780細胞的毒性作用

Fig 1 Cytotoxicity of DHA in A2780/T and A2780 cells

2.2 DHA對A2780/T細胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用

A2780和A2780/T細胞在分別用64 μmol·L-1和296 μmol·L-1DHA進行48 h的預(yù)處理后，加入不同濃度的紫杉醇(0～32 μmol·L-1)，合成曲線并分別計算IC50。我們發(fā)現(xiàn)，DHA作用后，A2780/T細胞的存活率曲線向左移動，而A2780細胞的曲線未見明顯變化(圖2)。表1結(jié)果顯示A2780/T細胞的IC50為5.42±1.45，而DHA作用后為1.83±0.53，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，DHA對A2780/T細胞紫杉醇耐藥的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.96。

圖2 DHA對紫杉醇在A2780及A2780/T細胞的細胞毒作用的影響

Fig 2 Effects of DHA on taxol toxicity in A2780 and A2780/T cells

表1 A2780/T 及A2780細胞對紫杉醇的藥敏試驗

Tab 1 The sensitivity test of taxol in A2780/T and A2780 cells

組 別IC50(x±s)/μg·ml-1逆轉(zhuǎn)倍數(shù)A2780/T組5.42±1.4512.96A2780/T+DHA296μmol·L-1組1.83±0.532A2780組0.046±0.007251.038A2780+DHA64μmol·L-1組0.045±0.005667

2.3 DHA促進Rh123在細胞里的聚集

為了探究DHA是否可以增加化療藥物在細胞中的含量，我們用Rh123試驗進行模擬。結(jié)果顯示：A2780細胞胞質(zhì)里Rh123的含量顯著高于A2780/T細胞(圖3A、B)。而A2780/T細胞中加入DHA(11～300 μmol·L-1)48 h后(圖3E～H)，Rh123的含量明顯增加，并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。圖3E～H分別與圖3C～D對比顯示，DHA和紫杉醇共同作用，細胞內(nèi)Rh123含量增加得更加明顯。

2.4 DHA改變A2780/T細胞的細胞周期分布

表2結(jié)果顯示，用3 μmol·L-1紫杉醇處理過的A2780/T細胞G0/G1期細胞所占比例為4.5%。而加入不同濃度DHA(33、100、296 μmol·L-1)后G0/G1期細胞逐漸增加，分別為5.7%、18.4%、20.5%。隨著DHA濃度的增加G0/G1期細胞比例逐漸增加，而M/G2期細胞所占比例呈劑量依賴性下降。

2.5 DHA下調(diào)MDR1 mRNA和MDR相關(guān)蛋白的表達

我們用實時定量PCR及蛋白質(zhì)印跡法檢測DHA對其表達的影響。圖4結(jié)果顯示：A2780/T細胞MDR1 mRNA(圖4A)、P-gp(圖4B)及其他MDR相關(guān)蛋白(MDR1、MRP、BCRP、LRP)(圖4C)表達量明顯高于A2780細胞。而DHA處理過的A2780/T細胞MDR1、P-gp、MRP、BCRP、LRP表達量明顯降低。并且，相對于單獨使用紫杉醇，紫杉醇與DHA聯(lián)合作用后MDR相關(guān)蛋白表達的下降更加明顯。

2.6 DHA抑制p38MAPK的磷酸化和NF-κB通路的激活

圖5的免疫印跡結(jié)果顯示：DHA和紫杉醇聯(lián)合處理過的A2780/T細胞表達的pp38 MAPK和NF-κB含量降低，但p38 MAPK的表達量沒有明顯區(qū)別。

3 討 論

n-3多不飽和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acids，n-3 PUFAs)是人類必需脂肪酸，在深海魚類及海藻中含量豐富。它可以預(yù)防腫瘤的發(fā)生，抑制腫瘤生長[4-5]。而其家族中的DHA和二十碳五烯酸(EPA)有著逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的功效。MDR是指細胞對某種化療藥物耐藥的同時，對其他結(jié)構(gòu)不同、作用靶點不同的抗腫瘤藥物也具有耐藥性。它是導致腫瘤化療失敗的重要原因之一。

圖3 DHA對Rh123在細胞內(nèi)聚集的影響

Fig 3 Effects of DHA on the accumulation of Rh123

表2 A2780/T細胞的細胞周期分布

Tab 2 Cell cycle distribution of A2780/T cells

DHA加入濃度/μmol·L-1不同周期細胞數(shù)G0/G1SM/G2χ2值P值0453(4.5)1137(11.4)8410(84.1)2058.17<0.00133570(5.7)937(9.4)8493(84.9)1001840(18.4)650(6.5)7510(75.1)2962057(20.5)1517(15.2)6426(64.3)

注：括號內(nèi)為百分比

圖4 DHA對MDR1mRNA和MDR相關(guān)蛋白表達的影響 A.MDR1 mRNA的相對表達； B.P-gp蛋白表達； C.MDR相關(guān)蛋白表達。control為A2780/T；Taxol為A2780/T+3 μmol·L-1Taxol；DHA為A2780/T+296 μmol·L-1DHA；Taxol+DHA為A2780/T+3 μmol·L-1Taxol+296 μmol·L-1DHA

Fig 4 Effects of DHA on MDR1 mRNA and MDR-related proteins

圖5 DHA 對p38 MAPK、pp38 MAPK及NF-κB表達的影響 control為A2780/T；Taxol為A2780/T+3 μmol·L-1Taxol；DHA為A2780/T+296 μmol·L-1DHA；Taxol+DHA為A2780/T+3 μmol·L-1Taxol+296 μmol·L-1DHA

Fig 5 Effect of DHA on expression of p38 MAPK，pp38 MAPK and NF-κB

已有研究證實n-3 PUFAs可以增加卵巢癌細胞對阿霉素的化療敏感性，同時還可以增加其對三氧化二砷的毒性反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)細胞的原發(fā)性或獲得性耐藥[6-7]。因此我們提出假說，DHA和EPA能夠逆轉(zhuǎn)卵巢癌紫杉醇耐藥細胞的耐藥性。在前期研究中，我們建立了卵巢癌耐紫杉醇細胞株A2780/T，經(jīng)測定，它的耐藥指數(shù)為430.7[8]。MTT結(jié)果顯示，EPA對A2780/T細胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用并不明顯。DHA明顯地增加了A2780/T細胞對紫杉醇的化療敏感性，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.96，而卵巢癌敏感細胞株A2780對紫杉醇的IC50，實驗組和對照組差異不具有統(tǒng)計學意義，推測DHA可能只在卵巢癌耐藥細胞中具有化療增敏作用。

前期對敏感細胞耐藥的細胞生物學行為研究顯示，A2780/T與A2780細胞的細胞周期分布趨勢并不相同[8]。本研究流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，DHA可以改變細胞周期的分布，增加非分裂期的細胞比率。

MDR的產(chǎn)生涉及多種作用機制，包括阻滯細胞周期、增加藥物外排、改變細胞通路的狀態(tài)等。本課題采用Rh123實驗監(jiān)測細胞外排的情況。耐藥細胞由于P-gp的藥物泵作用，胞內(nèi)Rh123的聚集較少。實驗結(jié)果表明DHA可以增加耐藥細胞胞內(nèi)Rh123即化療藥物的聚集，減少其外排作用，增加化療藥物對其的作用效果。蛋白質(zhì)印跡試驗中DHA作用后P-gp及其他MDR相關(guān)蛋白(MRP1、MRP2、BCRP、LRP)的表達下調(diào)又進一步驗證了這個結(jié)果。證明了減少藥物泵的外排是DHA耐藥逆轉(zhuǎn)作用的機制之一。據(jù)了解，目前已經(jīng)開發(fā)出了多種人工合成的P-gp抑制劑，然而，除了耐藥逆轉(zhuǎn)的功效，他們同時還產(chǎn)生嚴重的毒副作用。相對而言天然產(chǎn)物DHA的無毒性作用在臨床上的使用具有絕對優(yōu)勢。

MDR的產(chǎn)生與多種信號通路的異常激活相關(guān)，如MAPK和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt信號傳導途徑等[9-11]。有研究者發(fā)現(xiàn)葡萄籽的提取物通過抑制NF-κB和MAPK信號通路來逆轉(zhuǎn)MDR。目前已有報道稱，NF-κB含有MDR1基因的結(jié)合區(qū)域[12]。因此，NF-κB通路在MDR相關(guān)機制研究中被廣泛關(guān)注[13-14]。同時，p38 MAPK又被認為是NF-κB通路上游的調(diào)節(jié)酶[15]。我們據(jù)此猜測DHA逆轉(zhuǎn)A2780/T的耐藥性是通過抑制NF-κB和p38 MAPK通路而作用的。實驗的結(jié)果也證實了這個猜測：DHA顯著下調(diào)NF-κB和pp38 MAPK,而p38 MAPK未出現(xiàn)改變。也就是說，DHA抑制了NF-κB和p38 MAPK通路的激活。

綜上所述，DHA對卵巢癌耐藥細胞具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用，其機制與降低P-gp及其他MDR相關(guān)蛋白的功能和表達、抑制NF-κB通路的激活和p38 MAPK的磷酸化密切相關(guān)，然而更多的相關(guān)機制仍需進一步研究。我們相信，未來DHA可以作為輔助化療制劑運用到腫瘤的臨床治療中。

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Reversal effect of docosahexaenoic acid on taxol resistance in human ovarian carcinoma A2780/T cells

WU Yi-nan1，WANG Su-li1，WANG Ying-chun1，ZHAO Li-jun1，LU Jin1，WANG Jin-hua1，2

(1.DepartmentofGynecologicalOncologySurgery，JiangsuCancerHospital，NanjingMedicalUniversity，Nanjing210009，China； 2.DepartmentofGeneralSurgery，NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand，PLA，Nanjing210002，China)

Objective： To study the reversal effect of DHA on reversing drug resistance of taxol resistant ovarian cancer cells and to explore the underlying mechanisms in ovarian cancer cells. Methods： Using the MTT assay，the change of A2780/T cells resistant to taxol was determined. Drug efflux capacity in A2780/T cells was examined by flow cytometry using Rhodamine123(Rh123) intracellular accumulation assay. Cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry(FCM). Real-time PCR was used to detect expression of MDR1 mRNA. Expression of drug resistance related proteins and proteins involved in the mechanisms was examined by Western bloting. Results： DHA significantly reduced the values of IC50of A2780/T cells to taxol(P<0.05). Additionally， Rh123 intracellular accumulation assay demonstrated that DHA promoted the chemotherapeutic drug accumulation to exert the cytotoxic effect on A2780/T cells in a concentration dependent manner (P<0.05).Our results also showed that taxol combined with DHA could change the cell cycle distribution and prolong the cell cycle in G0/G1phase (P<0.05).Furthermore， we found that DHA down-regulated MDR related proteins， and suppressed the activation of NF-κB and phosphorylation of p38 MAPK. Conclusion： DHA reverses taxol resistance of A2780/T cells by changing the cell cycle distribution， inhibiting expression and function of P-gp and MDR related proteins， as well as blocking NF-κB and p38 MAPK pathways．

docosahexaenoic acid； ovarian carcinoma； taxol resistance； P-glycoprotein； nuclear factor-κ-gene binding； p38 mitogen-activated protein kinase

2015-05-14

2015-05-24

國家自然科學基金資助項目(81473636)；江蘇省醫(yī)學重點人才項目(RC2011091)

吳翌楠(1989-)，女，江蘇南京人，在讀碩士研究生。E-mail：wuyinan2909@sina.com

王金華 E-mail：wangjinhua588@163.com

吳翌楠，王蘇立，王迎春，等.DHA逆轉(zhuǎn)卵巢癌細胞A2780/T紫杉醇耐藥的機制研究[J].東南大學學報：醫(yī)學版，2015，34(5)：689-695．

R737.31; R979.1

1671-6264(2015)05-0689-07

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.003