納米銀聯合輻射后腦膠質瘤細胞凋亡與小膠質細胞的變化及其關系

劉培黨，金海振，趙靜，唐萌

(1.東南大學醫學院 神經生物學研究所，江蘇 南京 210009； 2.東南大學 江蘇省生物材料與器件重點實驗室，江蘇 南京 210009)

·論 著·

納米銀聯合輻射后腦膠質瘤細胞凋亡與小膠質細胞的變化及其關系

劉培黨1，2，金海振1，趙靜1，唐萌2

(1.東南大學醫學院 神經生物學研究所，江蘇 南京 210009； 2.東南大學 江蘇省生物材料與器件重點實驗室，江蘇 南京 210009)

目的：研究納米銀聯合輻射后大鼠腦膠質瘤細胞凋亡與瘤內小膠質細胞的變化及其關系。方法：將C6細胞立體定向接種于大鼠右側尾狀核，建模后第8天將荷瘤鼠隨機分成輻射對照組和納米銀聯合輻射組，分別立體定向注入等體積的去離子水及20 μg的納米銀，并行單次電離輻射。應用原位末端轉移酶標記(TUNEL)法和OX42免疫組織化學染色分別檢測輻射后瘤組織內細胞凋亡及小膠質細胞活性的動態變化。結果：TUNEL陽性細胞數目在輻射后6 h顯著增加，24 h明顯減少；輻射后6 h膠質瘤內小膠質細胞開始激活，隨著時間的延長活性進一步增強。輻射后6 h 和24 h，納米銀聯合輻射組TUNEL陽性細胞數目和小膠質細胞活性均較輻射對照組增加，差異有統計學意義(P<0.001)。小膠質細胞活化與膠質瘤細胞凋亡的變化趨勢不同，前者遲于后者。結論：納米銀聯合輻射后膠質瘤細胞凋亡增加，小膠質細胞活化；激活的小膠質細胞可能沒有參與膠質瘤細胞的急性凋亡過程。

納米銀； 膠質瘤； 電離輻射； 細胞凋亡； 小膠質細胞

腦膠質瘤約占全部顱內腫瘤的50%，是最常見的原發性中樞神經系統惡性腫瘤[1]。由于惡性膠質瘤具有侵襲性生長特性，手術難以完全切除，復發率高。輻射治療是腦膠質瘤重要的治療手段之一，但大部分膠質瘤對射線不敏感，輻射治療效果亦不佳[2]。如何增強膠質瘤細胞的輻射敏感性，一直是臨床上亟待解決的熱點問題。納米技術的出現為腫瘤的成像、診斷和治療提供了新的有力工具。金屬銀納米材料由于其獨特的抗菌、催化及非線性光學等性能，使其在生物、醫學等領域的研究中具有廣闊的應用前景。我們先前的研究發現，納米銀顆粒能夠顯著提高射線對膠質瘤細胞的殺傷作用[3-4]。

大量研究表明，細胞凋亡失衡與腫瘤的發生、發展及預后密切相關。更重要的是，輻射、化療等多種抗腫瘤治療的部分機制與誘導凋亡有關[5]。另外，作為中樞神經系統及其疾病中主要的免疫效應細胞，小膠質細胞參與許多生理和病理過程，尤其在殺傷腫瘤效應中發揮重要作用[6-7]。納米銀聯合輻射后，小膠質細胞是否參與膠質瘤細胞的凋亡過程尚不清楚。本研究在建立大鼠膠質瘤腦內模型的基礎上，通過立體定位向腫瘤內注入一定劑量的納米銀并進行電離輻射，觀察膠質瘤細胞凋亡和小膠質細胞的動態改變，以了解其在納米銀聯合輻射中的作用及關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.2主要儀器 單臂數字式腦立體定向儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，電離輻射儀(德國Siemens公司)，Olympus光學顯微鏡(日本Olympus公司)，CM-1900冰凍切片機和Leica圖像處理系統(德國Leica公司)，JEM-2000EX透射電子顯微鏡(TEM，日本JEOL公司)。

1.1.3動物和細胞 健康雄性Wistar大鼠24只，2～3月齡，體重220～260 g，購于東南大學動物實驗中心。大鼠C6膠質瘤細胞株購于中國科學院上海生物研究所。

1.2 方法

1.2.1C6膠質瘤細胞培養 細胞在含體積分數為10%胎牛血清的DMEM培養液中傳代培養至對數生長期，以不含乙二胺四乙酸二鈉的質量分數為0.25%的胰酶消化，離心后去除上清液，制成細胞懸液。臺盼藍染色檢測細胞活力，調整細胞濃度為1×108ml-1，置于37 ℃恒溫搖床待接種。

1.2.2荷瘤鼠模型制作及動物分組 大鼠用質量分數為0.4%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后，將頭部固定在腦立體定向儀上，參照Paxinos-Watson大鼠圖譜確定右側紋狀體移植靶點(前囟前1 mm、右旁開3 mm、硬腦膜下5 mm)。每只大鼠注入10 μl單細胞懸液，注射速度1 μl·min-1，注射完畢后留針5 min。將4只荷瘤鼠經灌注后蘇木素-伊紅(HE)染色，確定腫瘤分化程度；GFAP免疫組織化學染色，驗證膠質瘤的性質。將其余20只荷瘤大鼠隨機分為輻射對照組(瘤內注射去離子水加電離輻射)和納米銀聯合輻射組(瘤內注射20 μg納米銀加電離輻射)。每組根據輻射后不同時間再分為輻射后6 h和24 h兩個時間點，觀察細胞凋亡和小膠質細胞活性的變化。

1.2.3納米銀瘤內注入及輻射 建模后第8天，將各輻射組荷瘤大鼠麻醉后固定于腦立體定向儀上，原切口切開頭皮，尋找到原骨孔，分別抽取10 μl去離子水及等體積的納米銀懸液(20 μg，去離子水配制)立體定向注入相應瘤區。注射后24 h行6 MV電子線照射。每只動物共接受單次10 Gy照射，劑量率為200 cGy·min-1。

1.2.4組織學和免疫組織化學染色 將大鼠進行常規灌注固定，斷頭取腦，置于含質量分數為4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液(PB)后固定24 h后，入含質量分數為30%蔗糖的PB液至沉底。取瘤區所在腦組織行冠狀冰凍切片，片厚10 μm。相應組瘤組織行常規HE染色。將部分切片移入體積分數為3%的過氧化氫溶液，室溫下作用15 min。山羊血清封閉非特異性抗原，室溫下30 min。分別滴加一抗GFAP(1∶80)、OX42(1∶50)，4 ℃孵育過夜。加入生物素標記二抗工作液，37 ℃孵育60 min，PBS清洗3次，再加入堿性磷酸酶標記鏈霉卵白素37 ℃反應30 min。DAB顯色后，蘇木素復染，脫水透明，中性樹膠封片。

1.2.5TUNEL染色 取各輻射組剩余切片，按TUNEL試劑盒說明書原位檢測凋亡細胞，陰性對照為不加TDT酶。結果判定：細胞核中有棕色顆粒者為陽性細胞。每個標本選2張切片，計數每高倍視野中的凋亡細胞，共選6個高倍(400倍)視野，其均值為該標本的代表值。

由上述研究可知,超聲輔助對于食品原料中的類黑精提取有非常大的促進作用。類比其輔助萃取時的優點,例如破壞細胞壁細胞膜,促進生物活性物質釋放等,可以預測一些非熱加工技術在類黑精方面的輔助提取的前景,如高靜水壓萃取、高壓脈沖電場等。此外,超臨界流體萃取等技術還有綠色、清潔,減少有機試劑使用的優點。然而,這些技術在類黑精提取方面的應用報道較少,屬于較新領域。

1.2.6累積光密度的測定 累積光密度為OX42免疫組織化學染色陽性區域的每個像素點的光密度總和。累積光密度的大小反映OX42的活性變化。用Leica攝影顯微鏡進行圖像采集，用Image pro-Plus 6.0分析圖像中的累積光密度。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 納米銀的表征結果

TEM結果顯示，納米銀顆粒在形態上以球形為主，分散均勻，無團聚現象(圖1)。粒徑統計結果顯示，納米銀粒子單分散性較好，平均粒徑為(10.2±1.1) nm。

圖1 納米銀TEM照片

Fig 1 Image of nanosilver taken by TEM

2.2 膠質瘤組織學和GFAP免疫組織化學染色結果

腦膠質瘤HE染色結果顯示，腫瘤細胞密集成群，形態多樣，分化程度低，異型性高；免疫組化染色結果顯示腫瘤組織內GFAP表達較弱。

2.3 TUNEL染色結果

納米銀聯合輻射組膠質瘤細胞凋亡數目均比輻射對照組相應期瘤內細胞凋亡數目高(圖2)。輻射后6 h，聯合輻射組瘤內細胞凋亡數目與相應期的對照組比較，差異有統計學意義(P<0.001)。輻射后24 h細胞凋亡數目顯著減少，但聯合輻射組凋亡細胞數目仍較輻射對照組多(P<0.001)。

a 與相應期對照組相比，P<0.001

圖2 納米銀聯合輻射后膠質瘤細胞凋亡的變化

Fig 2 Changes in apoptosis of glioma cells following nanosilver plus radiation

2.4 小膠質細胞OX42染色結果

輻射后6 h兩組動物腦膠質瘤內OX42均有表達，但陽性細胞胞體多小而圓，突起較短，胞漿淺染，納米銀聯合輻射組OX42活性與輻射對照組相比差異有統計學意義(P<0.001，圖3A、B，圖4)。輻射后24 h OX42活性明顯增強，表現為OX42陽性細胞胞體增大，胞漿染色較深，部分細胞突起粗長，聯合輻射組OX42活性較輻射對照組明顯增高(P<0.001，圖3C、D，圖4)。輻射后24 h聯合輻射組可見大量OX42陽性細胞從瘤周組織向瘤區浸潤。

2.5 小膠質細胞活性變化與膠質瘤細胞凋亡的關系

小膠質細胞活化與膠質瘤細胞凋亡的變化趨勢不同，前者遲于后者。OX42累積光密度與膠質瘤細胞凋亡指標呈負相關(P<0.001)。

圖3 納米銀聯合輻射后OX42陽性細胞的變化(×400) A.輻射對照組，輻射后6 h； B.聯合輻射組，輻射后6 h； C.輻射對照組，輻射后24 h； D.聯合輻射組，輻射后24 h

Fig 3 Changes of OX42 positive cells following nanosilver plus radiation(×400) A.irradiated control group，6 h postirradiation; B.combined treatment group， 6 h postirradiation; C.irradiated control group，24 h postirradiation; D.combined treatment group，24 h postirradiation

a 與相應期對照組相比，P<0.001

圖4 納米銀聯合輻射后OX42陽性區域累積光密度的變化

Fig 4 Changes of the integrated optical densities of OX42 positive areas following nanosilver plus radiation

3 討 論

作為星形膠質細胞的主要中間絲蛋白，GFAP常被用作識別正常或病理情況下星形膠質細胞來源組織的標志物。大量研究證實，GFAP表達強度與膠質瘤惡性程度呈負相關[8]。本實驗結果顯示，C6腦膠質瘤細胞GFAP反應呈弱陽性，提示腫瘤分化程度低，惡性程度高。近年來，荷C6膠質瘤大鼠已作為高度惡性多形性膠質母細胞瘤動物模型廣泛用于腦膠質瘤病因學和藥效學等的研究[9-10]。

凋亡又稱為Ⅰ型程序性細胞死亡，是細胞死亡的機制之一。本研究結果顯示，輻射后6 h膠質瘤細胞凋亡數目比輻射后24 h明顯增多，這與文獻報道[11-12]一致。放射線能夠引起細胞凋亡，且凋亡高峰期主要發生在輻射后的最初幾個小時[11-12]。輻射后6 h和24 h，納米銀聯合輻射組膠質瘤細胞凋亡數目均比相應期輻射對照組高，提示納米銀輻射增敏殺傷膠質瘤細胞的部分機制可能與誘導細胞凋亡有關。

我們發現納米銀聯合輻射后小膠質細胞的活化具有時程效應，其活性較輻射對照組明顯增高。作為中樞神經系統中功能活躍的免疫細胞，小膠質細胞在損傷性刺激誘導的級聯反應中起到重要作用[13]。首先，激活的小膠質細胞通過吞噬清除腫瘤組織，發揮殺瘤效應。其次，促使多種炎癥細胞因子釋放增加，如腫瘤壞死因子α、白介素1等，加重炎癥反應[14]。第三，通過活化誘導型一氧化氮合酶，可以長時間地產生一氧化氮[15]。我們前期研究發現納米銀聯合輻射后腦膠質瘤內一氧化氮水平顯著增高[16]。過量的一氧化氮會由生理狀態下的調節因子轉變為細胞毒效應因子，直接或間接地促進腫瘤細胞死亡[15]。本研究觀察到，小膠質細胞反應明顯增強時間遲于膠質瘤細胞凋亡高峰時間，兩者的變化趨勢不同，提示小膠質細胞的激活可能沒有參與膠質瘤細胞的急性凋亡過程。

綜上所述，納米銀聯合輻射能夠促進膠質瘤細胞凋亡，誘導小膠質細胞活化。激活的小膠質細胞可能在納米銀聯合輻射殺傷膠質瘤細胞的效應中發揮一定的作用，但可能沒有參與納米銀增加輻射所誘導膠質瘤細胞的急性凋亡過程，其對膠質瘤細胞的遠期命運及轉歸的影響有待于進一步明確。對細胞死亡方式及相關介導因素的深入研究，有助于揭示納米銀輻射增敏殺傷膠質瘤細胞的作用機制。

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Changes in apoptosis of glioma cells and microglia activity and their correlation following nanosilver plus radiation

LIU Pei-dang1，2，JIN Hai-zhen1，ZHAO Jing1，TANG Meng2

(1.InstituteofNeurobiology，SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China； 2.JiangsuKeyLaboratoryforBiomaterialsandDevices，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective: To study the changes in apoptosis of glioma cells and microglia activity and their correlation following nanosilver plus radiation. Methods: C6 glioma cells were stereotactically transplanted into the rat’ right caudate nucleus. 8 days after inoculation， the tumor-bearing animals were randomly divided into the irradiated control group and combined treatment group， which then received intratumoral injections of deionized water or nanosilver of the same volume(20 μg)， followed by a single dose of ionizing radiation. The dynamic changes of apoptosis and microglia activity in the tumor tissue were examined by TUNEL assay and OX42 immunohistochemical staining， respectively. Results: The number of TUNEL-positive cells increased significantly 6 h after irradiation， and then dropped significantly 24 h postirradiation. Microglia activity was expressed 6 h after the radiation， and it grew further over time. Furthermore， compared with that in the irradiated control group， the number of TUNEL-positive cells and microglia activity increased significantly in the combined treatment group 6 h and 24 h after the radiation(P<0.001).The expression trends of microglia activity and TUNEL-positive cells were different， with the former being later. Conclusion: The combination of nanosilver with radiation can promote glioma cells apoptosis and activate microglia. The activated microglia may not participate in the acute process of glioma cell apoptosis．[Key words] nanosilver； glioma； ionizing radiation； apoptosis； microglia

2015-04-15

2015-05-04

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)項目(2013CB933904，2011CB933500)

劉培黨(1969-)，男，山東棗莊人，副教授，醫學博士。E-mail:seulpd@163.com

劉培黨，金海振，趙靜，等.納米銀聯合輻射后腦膠質瘤細胞凋亡與小膠質細胞的變化及其關系[J].東南大學學報：醫學版，2015，34(5)：679-683．

R739.41; R329.25

1671-6264(2015)05-0679-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.001