慢性乙型肝炎以及肝硬化患者腸道微生物研究

陳萌萌，鄭吉順，劉艷艷，李家斌

慢性乙型肝炎以及肝硬化患者腸道微生物研究

陳萌萌1，2，鄭吉順3，劉艷艷2，李家斌1

摘要目的 探討慢性乙型肝炎以及肝硬化患者的腸道菌群變化及其與細胞因子、肝功能之間的關系。方法 選取30例健康志愿者、50例肝炎后肝硬化患者以及50例慢性乙型肝炎患者，采用實時熒光定量PCR法檢測糞便中九種腸道菌群含量，比較三組間腸道菌群變化；同時采用ELISA法檢測慢性乙型肝炎患者血清中細胞因子如白介素17A（IL17）、白介素1β（IL1β）、白介素6（IL6）、干擾素α（INFα）、CXC趨化因子（CXCL13）的濃度，分析腸道菌群與細胞因子以及肝功能之間的關系。結果 與健康對照組相比，慢性乙型肝炎以及肝硬化患者體內(nèi)的雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌屬以及瘤胃球菌屬含量減少；腸桿菌科細菌、腸球菌、梭菌屬、白色念珠菌以及普雷沃氏菌含量明顯增加。慢性乙型肝炎患者體內(nèi)的腸桿菌科細菌與凝血酶原時間（PT）呈正相關性，腸球菌與谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）呈正相關性；雙歧桿菌與AST、堿性磷酸酶（AKP）以及HBV DNA水平呈負相關性，普雷沃氏菌屬與AST、AKP以及PT呈負相關性，擬桿菌屬與AST和PT呈負相關性，瘤胃球菌屬與白蛋白（ALB）呈負相關性。另外，9種腸道菌群中只有腸球菌與IL17A呈正相關性。結論 慢性乙型肝炎以及肝硬化患者體內(nèi)存在不同程度的腸道菌群失調(diào)，其中乙肝患者體內(nèi)過度繁殖的腸球菌與IL17A協(xié)同參與肝臟炎癥反應過程，以致于肝功能受損呈惡性循環(huán)狀態(tài)。

關鍵詞慢性乙型肝炎；腸道微生物；肝功能；細胞因子

2015-01-22接收

作者單位：

1安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院感染科，合肥 230022

2安徽省細菌耐藥監(jiān)控中心，合肥 2300223合肥市第一人民醫(yī)院感染科，合肥 230012

腸道菌群寄居在人體胃腸道內(nèi)各個部位，是一個種類繁多、動態(tài)變化的微生物群體。隨著對“腸-肝軸”概念的深入認知以及腸道微生態(tài)學研究的不斷進展，腸道菌群與慢性肝病的關系引起了廣泛的關注。既往研究［1-2］表明，慢性乙型肝炎患者的肝臟功能受到損傷后，可通過腸-肝軸改變膽汁的分泌、減少腸道的血供和蠕動等因素，導致腸道黏膜的破壞和腸道菌群失衡。但究竟是哪種腸道微生物在肝病發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用，其作用機制與細胞因子是否有關聯(lián)，目前尚不明確。該研究采用熒光定量PCR法檢測正常人、慢性乙型肝炎以及肝炎后肝硬化患者的腸道菌群，旨在闡明腸道菌群在肝病發(fā)展中所起的作用，并且對慢性乙型肝炎患者的腸道菌群與細胞因子以及肝功能之間的關系作進一步探討。

1　材料與方法

1.1 標本來源 50例慢性乙型肝炎患者和50例肝炎后肝硬化患者的糞便標本來源于安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院2012年7月～2014年2月住院患者，30例健康志愿者的糞便標本來源于安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院體檢中心（所有研究對象均簽署知情同意書并上報醫(yī)院倫理委員會批準），臨床診斷符合2011年版中華醫(yī)學會肝病學分會、中華醫(yī)學會感染病學分會聯(lián)合修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標準。病例入選條件：血清學乙肝標志物表面抗原陽性病史超過6個月，現(xiàn)在或曾有過肝功能異常，排除合并其他原因引起的肝功能損害；患者兩周內(nèi)未服用任何護肝抗病毒的藥以及抗生素。研究對象的臨床資料比較見表1。

表1　3組人群臨床資料比較（±s）

表1　3組人群臨床資料比較（±s）

與健康對照組比較：*P＜0.05；與慢性乙型肝炎組比較：＃P＜0.05；TBIL：總膽紅素；ALT：谷丙轉氨酶；AST：谷草轉氨酶；ALB：白蛋白；GGT：谷氨酰轉移酶；AKP：堿性磷酸酶；PT：凝血酶原時間

項目　　健康對照組　　慢性乙型肝炎組肝炎后肝硬化組人數(shù)（n）30　50　50性別（男／女）　14／16　16／34　12／38年齡（歲）　36.5±10.7　40.8±14.7　53.2±11.3糞便濕重（g）　198.4±23.9　200.4±21.2　201.4±23.2 TBIL（μmol／L）　12.7±3.2　45.6±43.4*　101.4±157.0*ALT（U／L）　23.9±5.8　682.8±668.9*　117.3±225.9*＃AST（U／L）　21.8±4.0　548.5±609.2*　123.3±173.0*＃ALB（g／L）　47.9±2.7　39.9±4.2*　31.5±7.9*＃GGT（U／L）　24.7±7.6　128.8±78.3*　119.7±143.3*AKP（U／L）　60.9±9.7　111.4±57.1*　151.3±94.7*＃PT（s）　12.0±0.4　14.1±2.2　17.6±14.0*HBV DNA水平（IU／ml）　　—6.7±13.0　6.8±14.0

1.2 標本采集 清晨采集隱血實驗陰性并且未被尿液污染的尾便于無菌容器中，將糞便攪勻后，用電子天平稱取200 mg分裝于無菌EP管中保存于-80℃待用。另外采集慢性乙型肝炎患者空腹靜脈血3 ml，分離血清后-20℃冷凍保存待測。

1.3 試劑與儀器 QIAmp DNA Stool Mini Kit試劑盒、Rotor-Gene3000熒光定量PCR儀購自德國Qiagen公司；TaKaRa SYBRPremix Ex TaqⅡ試劑盒、TaKaRa Taq酶、TaKaRa Easy dilution、TaKaRa Mini-BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit試劑盒以及pMDTM18-T Vector購自大連寶生物有限公司；細胞因子試劑盒購自武漢新啟迪生物有限公司；TProfessional Thermocycler PCR儀購自德國Biometra公司；Tanon 5200 multi凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能公司；Multiskan MK3酶標儀購自上海Thermo Fisher公司。

1.4 方法

1.4.1 糞便總DNA的抽提 使用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒法抽提糞便總DNA。將200 mg糞便與緩沖液ASL混勻，置于95℃水浴5 min，加入EXTablet抑制劑，室溫靜置后加入蛋白酶K和緩沖液AL。用乙醇沉淀DNA過柱洗脫后溶解于70 μl AE中，-80℃保存?zhèn)溆茫ň唧w抽提過程嚴格按照試劑盒說明書要求進行）。

1.4.2 常規(guī)PCR反應 9種腸道菌群的引物均參照相關文獻［3-6］，并用BLAST軟件在線核實其特異性后，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列見表2。以提取的糞便總DNA為模板，采用25 μl反應體系：10×PCR Buffer 2.5 μl，dNTP （2.5 mmol／L）2 μl，上、下游引物各1 μl，Taq酶（5 U／μl）0.2 μl，模板DNA 1 μl，ddH2O 17.5 μl。擴增反應條件：94℃預變性8 min，94℃變性1 min，退火45 s，72℃延伸30 s（雙歧桿菌45 s），循環(huán)32次，72℃后延伸10 min，4℃保存。取PCR反應產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統(tǒng)中分析擴增結果。

1.4.3 標準品質(zhì)粒的構建 將PCR擴增產(chǎn)物進行切膠回收純化并與pMDTM18-T載體連接，轉化到JM109感受態(tài)細胞中，經(jīng)藍白斑篩選，隨機挑取4個白色克隆。菌落PCR鑒定得到陽性克隆后，提取并純化質(zhì)粒DNA，送至大連寶生物工程有限公司測序。用紫外分光光度計準確定量后，根據(jù)以下公式計算出其拷貝數(shù)，進行10倍梯度稀釋，作為標準品保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

表2　9種腸道菌群的引物序列以及PCR反應條件

1.4.4 標準曲線的建立 以10倍梯度稀釋的質(zhì)粒標準品為模板進行實時熒光定量PCR。采用20 μl反應體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μl，模板2 μl，上、下游引物各0.8 μl，DEPC-ddH2O 6.4 μl。PCR擴增程序為：95℃預變性30 s；95℃變性8 s，退火20 s，72℃10 s（擬桿菌屬、乳酸桿菌、白色念球菌20 s，普雷沃氏菌屬以及雙歧桿菌30 s），循環(huán)40次。用起始模板拷貝數(shù)的lg值對每個稀釋標準品的CT值繪圖，最終得到標準曲線。

1.4.5 腸道菌群的定量檢測 實時熒光定量PCR反應體系及反應條件同上，對研究對象的DNA樣品進行檢測，同時設置空白對照。每個樣品要設置復孔并取平均值（復孔CT值相差不得超過0.5），根據(jù)測得的CT值與標準曲線得到樣品中DNA拷貝數(shù)。

1.4.6 細胞因子的檢測 按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中細胞因子白介素（interleukin，IL）-17A、IL-1、IL-6、干擾素-α（interferon-α，INF-α）、CXC趨化因子13（C-X-C motif chemokine 13，CXCL-13）水平，并用酶標儀記錄這些細胞因子的濃度。

1.5 統(tǒng)計學處理 用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，定量檢測所得的DNA拷貝數(shù)經(jīng)對數(shù)轉換后以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組資料比較采用單因素方差分析，兩兩指標的相關性采用Pearson相關性分析。

2　結果

2.1 引物特異性檢測 用1%瓊脂糖凝膠電泳分析常規(guī)PCR產(chǎn)物，以Marker為標準。可見常規(guī)PCR產(chǎn)物均顯示特異性條帶，與目的DNA片段長度相吻合。見圖1。

2.2 3組間腸道菌群的比較 與健康對照組相比，慢性乙型肝炎組和肝炎后肝硬化組的腸桿菌科細菌、腸球菌、梭菌屬、白色念珠菌以及普雷沃氏菌屬計數(shù)均顯著增加（P＜0.05）；而雙歧桿菌、擬桿菌屬以及瘤胃球菌屬計數(shù)均顯著減少（P＜0.05）。從DNA拷貝數(shù)來看，肝炎后肝硬化組的變化趨勢遠比慢性乙型肝炎組明顯。慢性乙型肝炎組的乳酸桿菌數(shù)量比健康對照組顯著減少（P＜0.001）；肝炎后肝硬化組的乳酸桿菌數(shù)量雖然比健康對照組有所減少，但兩組間差異無統(tǒng)計學意義。另外，肝炎后肝硬化組的乳酸桿菌和瘤胃球菌屬的數(shù)量明顯高于慢性乙型肝炎組（P＜0.05），其它菌屬比較兩組間差異無統(tǒng)計學意義。見表3。

2.3 慢性乙型肝炎患者的腸道菌群與肝功能以及HBV DNA水平之間的相關性分析 腸桿菌科細菌與PT呈正相關性（r＝0.29，P＝0.04）；腸球菌與ALT（r＝0.31，P＝0.03）以及AST（r＝0.29，P＝0.04）呈正相關性。雙歧桿菌與AST呈負相關性（r＝-0.37，P＝0.01），也與AKP（r＝-0.34，P＝0.02）以及HBV DNA水平（r＝-0.18，P＝0.05）呈負相關性。同樣的，普雷沃氏菌屬與AST呈負相關性（r＝-0.56，P＜0.001），也與AKP （r＝-0.30，P＝0.03）以及PT（r＝-0.29，P＝0.04）呈負相關性。擬桿菌屬與AST（r＝-0.44，P ＝0.01）和PT（r＝-0.37，P＝0.01）呈負相關性，而瘤胃球菌屬只與ALB呈負相關性（r＝-0.40，P＝0.01）。見表4。

表3　3組間腸道菌群的比較（±s）

表3　3組間腸道菌群的比較（±s）

與健康對照組比較：*P＜0.05；與慢性乙型肝炎組比較：＃P＜0.05

腸道菌群　　健康對照組（n＝30）慢性乙型肝炎組（n＝50）肝炎后肝硬化組（n＝50）腸桿菌科細菌　7.60±0.46　8.37±1.11*　8.85±0.84*糞腸球菌　5.72±0.42　6.90±1.00*　7.22±0.90*雙歧桿菌　8.31±0.96　7.49±1.16*　7.53±1.20*乳酸桿菌　8.46±1.42　6.92±1.36*　8.17±1.46＃梭菌屬　7.44±1.07　9.24±1.13*　9.68±0.98*白色念珠菌　5.83±0.23　6.28±0.29*　6.36±0.40*普雷沃氏菌屬　8.00±1.47　9.28±1.73*　9.59±1.52*擬桿菌屬　10.95±0.41　10.16±1.11*　9.96±1.38*瘤胃球菌屬　6.68±0.99　5.69±0.68*　6.09±0.74*＃

表4　慢性乙型肝炎患者的腸道菌群與肝功能以及HBV DNA水平之間的相關性分析

2.4 慢性乙型肝炎患者的腸道菌群與細胞因子之間的相關性分析 9種腸道菌群中只有腸球菌與IL-17A呈正相關性（r＝0.29，P＝0.04）。

3　討論

全球約有20億人口感染HBV，其中約有10% ～20%慢性乙型肝炎患者最終發(fā)展為失代償期肝硬化或肝癌，嚴重危害人類健康［7］。因此為有效救治慢性肝病患者，進一步揭示其發(fā)生發(fā)展的規(guī)律和機制，探索適當?shù)母深A和治療措施顯得尤為迫切。

本研究通過對9種腸道代表菌群的定量檢測，發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎以及肝硬化患者體內(nèi)存在不同程度的菌群失調(diào)，表現(xiàn)為雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌屬以及瘤胃球菌屬含量減少；腸桿菌科細菌、腸球菌、梭菌屬、白色念珠菌以及普雷沃氏菌含量明顯增加，與Liu et al［3］研究結果一致。腸桿菌科細菌在正常情況下屬于腸道非優(yōu)勢菌群，只有在特定的條件下具有侵襲性而對人體造成傷害。最新研究［6，8］表明肝硬化患者體內(nèi)的腸桿菌科細菌異常增多，而血漿內(nèi)毒素水平與腸桿菌科細菌數(shù)量呈正相關性，過度繁殖的腸桿菌科細菌產(chǎn)生大量的內(nèi)毒素釋放到腸腔內(nèi)，抑制腸上皮細胞的蛋白質(zhì)合成，繼而導致腸道屏障受損，出現(xiàn)細菌易位和腸道菌群失調(diào)，菌群失調(diào)又會加重腸桿菌科細菌過度繁殖，如此形成惡性循環(huán)。白色念珠菌在正常人腸道中含量極少，卻在慢性肝病患者腸道內(nèi)大大增加，這可能與患者延遲排便以及腸道活性降低有關［5］。文獻［9］已證實，慢性乙型肝炎患者的肝功能受損后會導致補體合成減少，使得機體免疫力下降以及網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞功能受損，進而導致條件致病菌如白色念珠菌迅速增殖。另外，肝硬化患者的肝功能嚴重受損，腸黏膜氧化應激造成腸黏膜屏障功能減退，腸道通透性增加，最終可能引發(fā)真菌感染［10］。

Arumugam et al［11］對22名志愿者的腸道微生物宏基因組進行測序比對，發(fā)現(xiàn)人體腸道中的微生物并非隨機組合，而是可以分為擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬和瘤胃球菌屬3個腸型，并且這些腸型與宿主的年齡、性別、種族、體重指數(shù)以及地域環(huán)境無關。腸道分型概念提出以后，不少研究者試著找出疾病與腸道分型之間的關聯(lián)，以便于篩選和預防某種疾病，最大限度地控制疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究通過定量檢測以上3種菌屬發(fā)現(xiàn)健康志愿者的擬桿菌屬含量高，肝病患者的普雷沃氏菌屬含量增加而擬桿菌屬含量減少。初步推測健康志愿者的腸道菌群屬于1類腸型，而慢性乙型肝炎以及肝硬化患者的腸道菌群屬于2類腸型。若要明確慢性肝病患者的腸道分型，還有待通過定量觀察微生物生態(tài)學（QIIME）技術做進一步的研究。

IL-17A是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型促炎性細胞因子，可以促進IL-1、IL-6、TNF-α、前列腺素E2和基質(zhì)金屬蛋白酶等的表達，引發(fā)組織細胞通透性增加，甚至壞死［12］。本研究結果表明，慢性乙型肝炎患者體內(nèi)腸球菌與IL-17A呈正相關性，可能是由于乙肝患者體內(nèi)腸球菌迅速繁殖，并產(chǎn)生大量多形核白細胞趨化因子［13］，介導肝臟發(fā)生炎癥反應，使得大量細胞因子（尤其是TGF-β、IL-23、IL-1β）釋放，Th-17細胞被活化，通過分泌并活化IL-17A來上調(diào)相關細胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-23 P19等，而這些細胞因子又會進一步加重肝臟的炎癥反應和損傷［14］。另外，研究顯示腸桿菌科細菌和腸球菌與反應肝臟損傷嚴重程度指標—肝功能以及PT呈正相關性，而乳酸桿菌與擬桿菌屬以及瘤胃球菌屬等益生菌與部分肝功能呈負相關性。這進一步說明慢性乙型肝炎患者的腸道菌群結構變化對肝臟組織有損傷作用，是HBV相關性肝病發(fā)生發(fā)展中不容忽視的致病因素。

綜上所述，慢性乙型肝炎以及肝硬化患者體內(nèi)存在不同程度的腸道菌群失調(diào)，其中乙肝患者體內(nèi)過度繁殖的腸球菌與IL-17A協(xié)同參與肝臟炎癥反應過程，使肝功能受損呈惡性循環(huán)狀態(tài)。因此，合理使用有效的微生態(tài)制劑來抑制腸道潛在致病菌的繁殖，對延緩和預防肝硬化的發(fā)生有著重要臨床意義。

參考文獻

［1］ Othman M，Agfiero R，Lin H C.Alterations in intestinal microbial flora and human disease［J］.Curt Opin Gastroenter，2008，24 （1）：11-6.

［2］ Shimizu K，Ogura H，Goto M，et al.Altered gut flora and environment in patients with severe SIRS［J］.J Trauma，2006，60 （1）：126-33.

［3］ Liu J，Wu D，Ahmed A，et al.Comparison of the gut microbe profiles and numbers between patients with liver cirrhosis and healthy individuals［J］.Curr Microbiol，2012，65（1）：7-13.

［4］ Di Cagno R，Rizzello C G，Gagliardi F，et al.Different fecal microbiotas and volatile organic compounds in treated and untreated children with celiac disease［J］.Appl Environ Microbiol，2009，

75（12）：3963-71.

［5］ Guo R Y，Chen Z J，Chen N，et al.Quantitative real-time PCR analysis of intestinal regular fungal species in fecal samples from patients with chronic hepatitis B virus infection［J］.Science，2010，41（10）：591-6.

［6］ Lu H，Wu Z，Xu W，et al.Intestinal microbiota was assessed in cirrhotic patients with hepatitis B virus infection［J］.Microb Ecol，2011，61（3）：693-703.

［7］ Trepo C，Chan H L，Lok A.Hepatitis B virus infection［J］.Lancet，2014，384（9959）：2053-63.

［8］ Chen Y，Yang F，Lu H，et al.Characterization of fecal microbial communities in patients with liver cirrhosis［J］.Hepatology，2011，54（2）：562-72.

［9］ Foschi F G，Trevisani F，Loggi E，et al.Effect of liver transplantation on tuftsin activity and phagocytic activity of neutrophil granulocytes in patients with liver cirrhosis［J］.Int Arch Allergy Immunol，2005，137（3）：258-62.

［10］Li J，Cheng L F，Li Z，et al.Intestinal intraepithelial lymphocytes in cirrhosis：Experiment with rats［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2008，88（4）：233-5.

［11］Arumugam M，Raes J，Pelletier E，et al.Enterotypes of the human gut microbiome［J］.Nature，2011，473（7346）：174-80.

［12］Zhang X，Angkasekwinai P，Dong C，et al.Structure and function of interleukin-17 family cytokines［J］.Protein Cell，2011，2（1）：26-40.

［13］Semedo T，Almeida Santos M，Martins P，et al.Comparative study using type strains and clinical and food isolates to examine hemolytic activity and occurrenceof the cyl operon in enterococci ［J］.J Clin Microbiol，2003，41（6）：2569-76.

［14］Zhang J Y，Zhang Z，Wang F S，et al.Interleukin-17-producing CD4（＋）T cells increase with severity of licer damage in patients with chronic hepatitis B［J］.Hepatology，2010，51（1）：81-91.

Changes of intestinal microbiota in patients with chronic hepatitis B and liver cirrhosis

Chen Mengmeng1，2，Zheng Jishun3，Liu Yanyan2，et al
（1Dept of Infectious Diseases，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；
2Anhui Center for Surveillance of Bacterial Resistance，Hefei 230022；
3Dept of Infectious Diseases，The First People’s Hospital of Hefei，Hefei 230012）

AbstractObjective To investigate changes of intestinal flora and correlation with cytokines and liver function in patients with chronic hepatitis B and liver cirrhosis.Methods 30 healthy subjects，50 patients with chronic hepatitis B and 50 patients with cirrhosis were selected.Nine kinds of intestinall flora were quantified by FQ-PCR to compare the changes among three groups.Then the IL-17A，IL-1β，IL-6，IFN-α，CXCL-13 concentrations in the serum of patients with chronic hepatitis B were measured with ELISA to explore the relationship between intestinal flora and cytokines，liver function.Results The numbers of Bifidobacterium，Lactobacillus，Bacteroides and Ruminococcus were significantly decreased in patients with chronic hepatitis B and liver cirrhosis compared with healthy controls，while the numbers of Enterobacteriaceae，Enterococcus，Clostridium，Candida albicans and Prevotella were significantly increased.Positive correlations were found between Enterobacteriaceae and PT，as well as Enterococcus and ALT，AST in patients with chronic hepatitis B.Bifidobacterium was negatively linked to AST，AKP，HBV DNA.Prevotella was negatively linked to AST，AKP，PT.There was a negative correlation between Ruminococcus and ALB，as well as Bacteroides and AST，PT.In addition，Enterococcus was positively linked to IL-17A.Conclusion Varying degrees of intestinal flora imbalance exists in patients with chronic hepatitis B and liver cirrhosis.The overgrowth of Enterococcus acts synergistically with IL-17A to induce liver inflammation and result in impaired liver function.

Key wordschronic hepatitis B；intestinal microbiota；liver function；cytokines

作者簡介：陳萌萌，女，碩士研究生；李家斌，男，教授，博士生導師，責任作者，Email：lijiabin948＠vip.sohu.com

基金項目：國家自然科學基金（編號：81172737）

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）05-0648-05

中圖分類號R 512.6