LPS對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2增殖、凋亡及分泌炎癥因子的影響

劉亞婷，李 濤，徐恩君，周 敏，徐元宏，沈繼龍

LPS對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2增殖、凋亡及分泌炎癥因子的影響

劉亞婷1，李 濤1，徐恩君1，周 敏2，徐元宏1，沈繼龍3

摘要目的 體外觀察不同濃度細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖（LPS）對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖、凋亡以及分泌炎癥因子的影響，并探討可能的機(jī)制。方法 按照隨機(jī)數(shù)字法將細(xì)胞分為對(duì)照組及1、10、50、100 μg／ml LPS處理組。用MTT檢測(cè)刺激24、48、72和96 h后細(xì)胞的增殖能力；用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)刺激24 h后細(xì)胞的凋亡情況；用RT-PCR法檢測(cè)刺激24 h后白介素-6（IL-6）和白介素-8（IL-8）mRNA的表達(dá)含量；用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)刺激24 h后IL-6和IL-8的表達(dá)量，最后用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 與對(duì)照組比較，各處理組刺激24 h和48 h后細(xì)胞增殖活性明顯升高（P＜0.05），而在72、96 h差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；刺激24 h后，1、10、50和100 μg／ml LPS處理組以及對(duì)照組之間的細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；刺激24 h后，與對(duì)照組比較，隨著刺激濃度的升高，IL-6和IL-8的表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論 LPS可以在48 h內(nèi)促進(jìn)HepG2的增殖，對(duì)HepG2細(xì)胞的凋亡沒(méi)有影響，并且LPS作用可以上調(diào)IL-6 和IL-8水平。

關(guān)鍵詞脂多糖；HepG2細(xì)胞；增殖；凋亡；炎癥因子

2015-03-10接收

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1檢驗(yàn)科、2ICU，3安徽人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230032

肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，在中國(guó)城鄉(xiāng)居民的發(fā)病率和死亡率都很高［1］。細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可以誘導(dǎo)免疫細(xì)胞和炎癥相關(guān)細(xì)胞表達(dá)分泌大量的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，參與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。臨床研究［2］表明，肝炎患者的血清LPS濃度明顯高于正常人，說(shuō)明LPS對(duì)肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生重要的影響。該研究探討不同濃度LPS體外刺激肝癌HepG2細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞的增殖、凋亡以及分泌炎癥因子的影響。

1　材料與方法

1.1 材料 HepG2細(xì)胞株來(lái)自安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院科研中心細(xì)胞庫(kù)；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；MTT試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；凋亡試劑盒購(gòu)自上海貝博公司；脂質(zhì)體Lipofectamine2000、總RNA提取試劑TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；引物由上海生工技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自加拿大Fermentas公司；2 000 bp DNA Ladder Marker購(gòu)自日本TaKaRa公司；白介素-6（interleukin-6，IL-6）和白介素-8（interleukin-8，IL-8）試劑盒購(gòu)自德國(guó)西門子公司。

1.2 方法

1.2.1 HepG2細(xì)胞培養(yǎng) 應(yīng)用DMEM高糖培養(yǎng)基（添加10%的胎牛血清，1%的青霉素和鏈霉素）于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁率達(dá)80%～90%時(shí)用胰酶消化，細(xì)胞活率在90%以上進(jìn)行傳代。

1.2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 在實(shí)驗(yàn)前1 d，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，按照隨機(jī)數(shù)字表法將其分為對(duì)照組以及1、10、50、100 μg／ml LPS處理組，使每孔細(xì)胞數(shù)為5× 103個(gè)，每組5個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞完全貼壁后，在各組細(xì)胞中分別添加0、1、10、50、100 μg／ml的LPS繼續(xù)培養(yǎng)。刺激24、48、72、96 h，各孔加入MTT溶液（5 mg／ml）20 μl，培養(yǎng)4 h后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μl，震蕩10 min。使結(jié)晶充分溶解，用酶聯(lián)免疫標(biāo)記分析儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)的光密度（optical density，OD）值。測(cè)各孔的吸光度值，取各組值的均數(shù)表示細(xì)胞的增殖情況。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 在實(shí)驗(yàn)前1 d，將細(xì)胞以每孔5×105個(gè)接種于6孔板中，分組培養(yǎng)同1.2.2（每組3個(gè)復(fù)孔）。將各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h，胰酶消化后1 000 r／min離心5 min，PBS洗滌2次，按照Annexin V-FITC／PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)

明書步驟操作，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)IL-6、IL-8 mRNA表達(dá) 在實(shí)驗(yàn)前1 d，將細(xì)胞以每孔5×105個(gè)接種于6孔板中，分組培養(yǎng)同1.2.2（每組3個(gè)復(fù)孔）。將各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞上清液，TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，cDNA合成按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。PCR擴(kuò)增：從基因庫(kù)中查出IL-6、IL-8的全基因序列，采用Prime Primier 5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，IL-6上游引物：5’-GTCCAGTTGCCTTCTCCC-3’，下游引物：5’-GCCTCTTTGCTGCTTTCA-3’，產(chǎn)物為223 bp，退火溫度56℃；IL-8上游引物：5’-CTTTGTCCATTCCCACTTCTGA-3’，下游引物：5’-TCCCTAACGGTTGCCTTTCTAT-3’，產(chǎn)物為267 bp，退火溫度為56℃；采用β-actin作為內(nèi)參照，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min后，95℃變性30 s，56.4℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。TLR4的反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min后，95℃變性30 s，52.9℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。產(chǎn)物置于2%的瓊脂糖凝膠電泳（100 V，25 min），采用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行掃描分析。

1.2.5 化學(xué)發(fā)光法 -80℃冰箱取出已收集的各組上清液，室溫溶解。按照西門子公司IL-6與IL-8檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書步驟操作，利用IMMULITE 1000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)各組上清液中IL-6與IL-8的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，定量資料多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗(yàn)，定性資料比較采用方差分析。

2　結(jié)果

2.1 不同濃度LPS處理HepG2細(xì)胞后在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)其增殖的影響 刺激24、48 h后，1、10、50、100 μg／ml LPS處理組細(xì)胞增殖活性均高于對(duì)照組（F＝78.7、121.4，P＜0.05），且隨著濃度的上升，增殖活性也不斷的升高；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，刺激72、96 h后，各組細(xì)胞增殖活性沒(méi)有明顯的差異（P＞0.05），見圖1。

2.2 不同濃度LPS處理后對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡能力的影響 刺激24 h后，1、10、50、100 μg／ml LPS處理組以及對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率分別為（2.53± 0.24）%、（2.72±0.32）%、（2.64±0.25）%、（2.89 ±0.42）%、（2.41±0.31）%。組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝3.154，P＞0.05）。即不同濃度LPS處理HepG2對(duì)其凋亡能力沒(méi)有影響，見圖2。

2.3 不同濃度LPS處理HepG2細(xì)胞后IL-6、IL-8 mRNA表達(dá) 刺激24 h后，以目的基因的灰度值／內(nèi)參的灰度值來(lái)表示目的基因的相對(duì)表達(dá)含量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，隨著刺激濃度的升高，IL-6、IL-8 mRNA的相對(duì)表達(dá)含量有明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

2.4 不同濃度LPS對(duì)HepG2釋放細(xì)胞因子IL-6 和IL-8的影響 不同濃度LPS在刺激HepG2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞釋放的IL-6和IL-8的量與對(duì)照組相比顯著升高（P＜0.05），并且隨著濃度的增大，IL-6和IL-8的量也逐漸升高，見表1。

表1　化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)不同濃度LPS刺激HepG2后IL-6和IL-8的表達(dá)量（pg／ml，±s）

表1　化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)不同濃度LPS刺激HepG2后IL-6和IL-8的表達(dá)量（pg／ml，±s）

細(xì)胞因子　LPS的濃度（μg／ml）0 1 10　50　100　F值　P值IL-6　11.3±2.7　21.4±2.9　30.2±1.8　40.7±3.2　48.5±2.1　419.44　0.00 IL-8　14.2±1.3　29.3±3.4　41.5±1.9　47.8±2.9　54.2±1.6　357.71　0.00

3　討論

慢性炎癥在不同器官如肺、結(jié)腸和肝臟腫瘤的發(fā)生過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用［3］。在慢性乙肝疾病患者中LPS往往有較高表達(dá)。LPS是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要組成成分，對(duì)LPS的識(shí)別與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是機(jī)體自身防御反應(yīng)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，也是導(dǎo)致內(nèi)毒素性休克、全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能衰竭等疾病的重要機(jī)制。研究［4］已經(jīng)證實(shí)LPS主要是通過(guò)TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活胞內(nèi)信號(hào)分子，影響其生物學(xué)特性。由于TLR4在HepG2細(xì)胞上也有表達(dá)，所以本研究可以直接用LPS處理來(lái)觀察其對(duì)HepG2細(xì)胞的一些作用。

已有報(bào)道［5］指出，LPS可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞TLR4信號(hào)系統(tǒng)的激活，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞生存和增殖。本研究用MTT法檢測(cè)不同時(shí)間及濃度下LPS刺激后細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果顯示，在培養(yǎng)24 h和48 h后，隨著LPS濃度的增高，細(xì)胞的增殖能力也不斷提高，且呈劑量依賴性。而隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖能力沒(méi)有太大的影響，而在培養(yǎng)96 h時(shí)，LPS的刺激反而對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖有一定抑制作用。可能的原因是在不同的時(shí)間節(jié)點(diǎn)和不同的LPS刺激濃度下，LPS激活的主要信號(hào)途徑可能并不相同，誘導(dǎo)的相關(guān)因子表達(dá)也不一樣，以至于對(duì)細(xì)胞增殖的效應(yīng)出現(xiàn)變化。對(duì)此，本研究又分別通過(guò)RT-PCR及化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)了兩種重要炎癥因子IL-6、IL-8的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)不同濃度LPS在刺激HepG2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞釋放的IL-6和IL-8的量與對(duì)照組相比顯著升高，并且隨著濃度的增大，IL-6 和IL-8的量也逐漸升高。由于IL-6和IL-8不僅可以作為重要炎癥因子調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，還能夠提高多種細(xì)胞的增殖能力?？赡苁荌L-6和IL-8在LPS對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖調(diào)節(jié)過(guò)程中扮演了一定的角色。LPS還能夠刺激巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞分泌一些因子，激活先天免疫反應(yīng)，同時(shí)它還能夠誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞、皮細(xì)胞等多種細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了各LPS處理組及對(duì)照組24 h HepG2細(xì)

胞的凋亡情況，顯示不同濃度LPS處理HepG2對(duì)其凋亡能力沒(méi)有影響，這與金生等［6］的研究一致?？赡苁怯捎诟鹘MLPS的濃度還未達(dá)到能夠使HepG2細(xì)胞凋亡的程度，也可能是由于不同濃度的LPS激活了不同的增殖、凋亡信號(hào)途徑，最終使得各個(gè)處理組及對(duì)照組的凋亡率沒(méi)有明顯差異。

LPS可以通過(guò)刺激炎癥細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子水平，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管生成、腫瘤入侵及轉(zhuǎn)移［7］。本研究以LPS刺激對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2增殖、凋亡及釋放細(xì)胞因子的影響展開研究，為明確LPS在肝癌中發(fā)揮的作用及發(fā)揮作用的可能機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］ Chen W，Zheng R，Zhang S，et al.The incidences and mortalities of major cancers in China［J］.Chin J Cancer，2013，32（3）：106 -12.

［2］ 程曉宇，張倫理.CD14和Toll樣受體4的表達(dá)在內(nèi)毒素致肝炎重型化中的意義［J］.中華肝臟病雜志，2010，18（6）：428-32.

［3］ Grivennikov S I，Greten F R，Karin M.Immunity，inflammation，and cancer［J］.Cell，2010，140（6）：883-99.

［4］ Sender V，Stamme C.Lung cell-specific modulation of LPS-induced TLR4 receptor and adaptor localization［J］.Commun Integr Biol，2014，7：e29053.

［5］ Wang L，Zhu R，Huang Z，et al.Lipopolysaccharide-induced toll-like receptor 4 signaling in cancer cells promotes cell survival and proliferation in hepatocellular carcinoma［J］.Dig Dis Sci，2013，58（8）：2223-36.

［6］ 金 生，張大志，陳壓西，等.乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)染及脂多糖刺激對(duì)HepG2細(xì)胞Toll樣受體2和4表達(dá)的影響［J］.中華傳染病雜志，2006，24（4）：230-4.

［7］ Pollard J W.Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis［J］.Nat Rev Cancer，2004，4（1）：71-8.

Effects of LPS on proliferation，apoptosis and secretion of cytokines of hepatocellular carcinoma cell line HepG2

Liu Yating，Li Tao，Xu Enjun，et al
（Dept of Clinical Laboratory，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

AbstractObjective To observe the effects of different concentrations of LPS on proliferation，apoptosis and secretion of cytokines of liver cancer cell line HepG2 in vitro，and to explore their possible mechanism.Methods The cells were divided into control group and 1，10，50，100 μg／ml LPS treatment groups according to the method of random number.The proliferation of HepG2 cells at post treatment hour（PTH）24，48，72 and 96（denoted as absorption value）was detected by MTT and the apoptosis of HepG2 cells at PTH 24 was detected by flow cytometer.The level of IL-6 and IL-8 mRNA was detected by RT-PCR at PTH 24 and the concentration of IL-6 and IL-8 was detected at PTH 24 by chemiluminescence immunoassay.The data were analyzed with SPSS19.0.Results

Compared with the control group，proliferation of HepG2 cells was significantly increased（P＜0.05）in the treatment groups at PTH 24 and 48，but there was no statistically significant difference in proliferation of HepG2 cells at PTH 72 and 96（P＞0.05）.There was no statistically significant difference in apoptosis rate of HepG2 cells at PTH 24 between the groups.Compared with the control group，the expression of IL-6 and IL-8 was significantly increased with the increase in concentration of LPS at PTH 24.Conclusion LPS can promote the proliferation of HepG2 cells in 48 hours and has no effect on apoptosis of HepG2 cells.LPS can also up-regulate the expression of IL-6 and IL-8 in HepG2 cells.

Key wordslipopolysaccharide；HepG2 cells；proliferation；apoptosis；inflammatory cytokines

作者簡(jiǎn)介：劉亞婷，女，碩士研究生；李 濤，男，副教授，副主任技師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：limedical1974＠126.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30801088、81201488）；衛(wèi)生部應(yīng)用研究項(xiàng)目“高通量ELISA檢測(cè)系統(tǒng)化、標(biāo)準(zhǔn)化系列研究”（編號(hào)：28-1-50）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-1492（2015）05-0604-04

中圖分類號(hào)R 73-3