均相酶免疫分析技術(shù)在治療藥物監(jiān)測中的應(yīng)用

齊謝敏，虞留明，李 冬，朱婷婷，儲小曼*南京軍區(qū)南京總醫(yī)院藥理科，南京 000；蘇州博源醫(yī)療科技有限公司，蘇州 563

均相酶免疫分析技術(shù)在治療藥物監(jiān)測中的應(yīng)用

齊謝敏1，虞留明2，李 冬2，朱婷婷1，儲小曼1*
1南京軍區(qū)南京總醫(yī)院藥理科，南京 210002；2蘇州博源醫(yī)療科技有限公司，蘇州 215163

均相酶免疫技術(shù)是一種基于液相均相競爭性反應(yīng)體系的免疫測定技術(shù)，目前，基于該技術(shù)建立的藥物濃度測定方法以其獨特優(yōu)勢已成功應(yīng)用于臨床治療藥物和興奮劑等小分子以及蛋白質(zhì)等大分子的檢測，但大多依靠進口試劑。本文對均相酶免疫技術(shù)的研究現(xiàn)狀、技術(shù)原理、技術(shù)優(yōu)點進行了綜述，重點介紹了該技術(shù)在治療藥物監(jiān)測方面的臨床應(yīng)用以及需要注意的問題，并對該技術(shù)的應(yīng)用前景進行了展望。該技術(shù)具有檢測速度快、特異性強、自動化程度高等優(yōu)點，但面臨進口試劑價格昂貴、運送周期長等問題，因此我國對該技術(shù)的自主研發(fā)平臺及試劑需求顯得尤為迫切。

均相酶免技術(shù)；治療藥物監(jiān)測；半抗原；開放式生化儀

一些藥物由于其生物利用度及藥動學(xué)的個體差異大、治療窗范圍窄、治療劑量與中毒劑量接近等因素，導(dǎo)致臨床極易發(fā)生中毒反應(yīng)或療效不佳[1-3]。因此，必須檢測這些藥物的體內(nèi)濃度，為臨床制定個體化給藥方案提供參考依據(jù)。而準確、快速的藥物濃度監(jiān)測方法是合理給藥方案的前提。始于20世紀60年代的治療藥物檢測 （therapeutic drug monitoring，TDM）通過測定體液中藥物濃度，能有效監(jiān)測患者藥物治療效果，根據(jù)患者臨床特點設(shè)計個體化給藥方案，指導(dǎo)臨床個體化用藥，及時避免因藥物濃度過高而引發(fā)的毒副反應(yīng)或藥物濃度過低、延誤疾病的治療。均相酶免疫技術(shù)（homogeneous enzyme immunoassay，HEIA）作為一種藥物濃度檢測方法，因其獨特優(yōu)勢在國外已應(yīng)用多年。該技術(shù)是一種基于液相均相體系的競爭性反應(yīng)，兼具了“抗原和抗體”及“酶和底物”兩種系統(tǒng)的特點，具有檢測速度快、定量準確、精密度高、特異性強等優(yōu)點。同時可應(yīng)用于各種類型的生化分析儀，實現(xiàn)樣本的高通量和自動化測定，可用于檢測治療藥物、興奮劑等分子量在2000道爾頓以下小分子，也可用于多肽、蛋白質(zhì)及多糖等大分子的檢測[4-6]，具有廣泛的應(yīng)用前景。

HEIA技術(shù)在國外報道較早，但由于技術(shù)難度大，能夠應(yīng)用此技術(shù)研發(fā)臨床診斷試劑的公司并不多。美國Syva公司于1972年首次報道該技術(shù)，其注冊商標為酶擴大免疫測定技術(shù) （enzyme multiplied immunoassay technique，EMIT），但該公司的 EMIT產(chǎn)品直到 20世紀90年代才廣泛應(yīng)用于TDM和毒品檢驗領(lǐng)域。隨著基因工程的發(fā)展，Thermofisher公司的Henderson等于1986年開發(fā)出克隆酶供體免疫測定（clone enzyme donor immunoassay，CEDIA）方法，均相酶免疫技術(shù)得到了進一步發(fā)展。HEIA技術(shù)主要用于小分子物質(zhì)的測定，由于新一代抗體技術(shù)可以通過特異性小分子多肽片段（2～12個氨基酸）制備抗蛋白質(zhì)抗體，HEIA技術(shù)也應(yīng)用到蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的檢測[7]。

目前，國外只有西門子 （Siemens）、賽默飛世爾（Thermofisher）、奎斯特（Quest Diagnostics）等公司擁有基于HEIA開發(fā)的試劑，例如西門子開發(fā)的Emit?2000 Vancomycin Assay kit等。國內(nèi)研發(fā)HEIA試劑的IVD（in vitro diagnos tic）公司較少，應(yīng)用于臨床檢測的HEIA試劑一直處于空白狀態(tài)。近年來，國內(nèi)已有IVD企業(yè)開始自主研發(fā)HEIA技術(shù)平臺，并且已成功運用此技術(shù)平臺開發(fā)出甘膽酸檢測試劑、TDM系列試劑等多種可用于臨床檢驗的產(chǎn)品，填補了國內(nèi)空白[8]。

1 均相酶免疫分析技術(shù)原理

HEIA技術(shù)運用競爭結(jié)合的分析方法，酶標記半抗原和非標記半抗原具有相同的與限量抗體競爭結(jié)合的能力。抗體與酶標記半抗原結(jié)合后，形成空間位阻，封閉了酶與底物的結(jié)合位點，從而降低酶對底物的催化效率。通過測定底物終端物的特定波長的吸光度變化，即可測定反應(yīng)系統(tǒng)中總酶活性變化，推算出被測樣本中半抗原含量。用于HEIA的標記酶有溶解酵素[9]、蘋果酸脫氫酶[10]、β-D-半乳糖苷酶[11]以及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）等[12-13]，目前常用的為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。

以G6PDH為例，HEIA技術(shù)原理是：“G6PDH-小分子（半抗原）”偶聯(lián)物催化6-磷酸葡萄糖（G6P）轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖酸（6PG），同時將輔酶氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）轉(zhuǎn)化成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），NADH在340 nm處有吸收峰，在無抗體和分析物時，整個反應(yīng)的信號最強，達到“+++++”（圖1a）。

有抗體而無待測物時，“G6PDH-小分子”偶聯(lián)物與抗體結(jié)合，G6PDH的活性受到抗體最大限度的抑制，整個反應(yīng)的信號最弱，為“+”（圖1b）。

實際測定時，待測物競爭性結(jié)合部分抗體，與抗體結(jié)合的“G6PDH-小分子”偶聯(lián)物被釋放出來。待測物越多，釋放出來的酶標記偶聯(lián)物就越多，反應(yīng)信號也就越強。通過建立340 nm處吸光值與待測物標準品濃度的標準曲線，計算出未知樣本濃度（圖1c）。

圖1 HEIA技術(shù)原理

2 均相酶免疫分析技術(shù)的優(yōu)點

TDM技術(shù)主要有光譜法、色譜法、免疫法三類。光譜法由于其靈敏度低、所需樣本量大而在臨床檢測中受限；色譜法雖提高了靈敏度，但對樣本前處理及所需試劑、樣本的純凈度要求均較高，不符合臨床快速、簡便的操作需求；非均相酶免疫測定法需分離結(jié)合和游離的標記物，才能測定各自濃度，操作繁瑣。而HEIA發(fā)生在一個液相均相體系中，無需分離結(jié)合與游離的標記物，具有如下突出優(yōu)點：

（1）特異性強、定量準確。使用的抗體可特異性地針對待測物，增強母體藥物專屬性，減少代謝物交叉反應(yīng)。影響特異性的主要原因是交叉反應(yīng)，主要來源于結(jié)構(gòu)類似物或藥物代謝物產(chǎn)生的非特異性信號，而HEIA是基于抗原-抗體反應(yīng)，專一性強，能識別化學(xué)結(jié)構(gòu)非常相似的物質(zhì)，甚至是立體異構(gòu)體。

（2）靈敏度高，可達到pg/mL水平[14]。HEIA中酶標記半抗原與抗體結(jié)合后產(chǎn)生空間位阻降低酶活性，一旦待測物與其競爭結(jié)合抗體，釋放出來的酶標記半抗原對其催化的底物高度靈敏，從而產(chǎn)生檢測信號，靈敏度較高。

（3）精密度高，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于 5%。由于HEIA是通過酶催化反應(yīng)檢測吸光度進行定量，其試劑性質(zhì)較穩(wěn)定；化學(xué)發(fā)光、放射免疫法可能產(chǎn)生信號衰減導(dǎo)致反應(yīng)結(jié)果不穩(wěn)定，而HEIA通過檢測吸光值定量，信號重現(xiàn)性好；HEIA是均相反應(yīng)體系，完全消除了抗原、抗體分離帶來的誤差，進一步提高方法精密度和重現(xiàn)性。

（4）檢測時間短、通量高。HEIA在液相均相體系中完成，抗體抗原反應(yīng)達到平衡的時間比固相短；且酶促反應(yīng)時間較短，在數(shù)十秒內(nèi)即可檢測到吸光值變化。以O(shè)lympus5400型生化分析儀為例， 每小時檢測樣本量超過2000例。

（5）操作簡便、自動化程度高，可在開放式生化分析儀進行檢測。樣本前處理一般只需分離血清或血漿即可；HEIA在均相反應(yīng)體系進行，不需分離抗原抗體，簡化操作；通過檢測吸光值定量，普通生化儀即可滿足檢測要求，分析儀可識別樣本條碼，使結(jié)果與樣本完全匹配。

3 均相酶免疫技術(shù)在TDM中的應(yīng)用

用藥不當致死率遠遠高于同期各種傳染病死亡率，而用藥不當死亡人數(shù)中，大多是劑量不當所致。TDM指導(dǎo)下制定和調(diào)整的給藥方案是藥物治療學(xué)發(fā)展的必然趨勢，它將臨床用藥從傳統(tǒng)經(jīng)驗?zāi)Ｊ教岣叩礁茖W(xué)的水平，而精確的監(jiān)測手段使TDM臨床應(yīng)用得以實現(xiàn)。國外早期HEIA技術(shù)應(yīng)用主要集中于TDM[15]。1975年Bastiani[16]首先報道了利用HEIA技術(shù)測定苯妥因及苯巴比妥的含量。此后，國外學(xué)者又陸續(xù)報道了利用HEIA測定甲氨喋呤[17]、丁丙諾菲[18]、卡馬西平[19]、芬太尼等藥物濃度。

抗癲癇藥物副作用較大，蔣穎等[20]對EMIT測定的患者丙戊酸、卡馬西平等抗癲藥物血藥濃度結(jié)果進行回顧性調(diào)查，維持有效血藥濃度具有可觀的療效，而重要的TDM數(shù)據(jù)是真正做到個體化給藥的必要途徑之一。

免疫抑制劑主要用于預(yù)防治療移植術(shù)后排異反應(yīng)和移植物抗宿主病，濃度過高過低產(chǎn)生高毒性或排異反應(yīng)，導(dǎo)致移植失敗，TDM可有效預(yù)防不良反應(yīng)發(fā)生。有報道采用HEIA法測定45例腎移植患者體內(nèi)免疫抑制劑他克莫司血藥濃度，73.7%的檢測結(jié)果均在有效血藥濃度范圍內(nèi)，定期檢測他克莫司的血藥濃度，對避免患者發(fā)生中毒或排斥反應(yīng)意義重大[21]。Luo等[22]采用EMIT技術(shù)簡便、快速地檢測腎移植患者體內(nèi)環(huán)孢素A血藥濃度，驗證了其100～400 ng·mL-1的治療劑量，當高于或低于該界限時，毒性反應(yīng)和排異率明顯增加，根據(jù)TDM結(jié)果調(diào)整劑量可避免不良反應(yīng)發(fā)生，對保證臨床療效和安全有著重要的作用。有報道稱，EMIT和熒光偏振免疫分析法（fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA）測定環(huán)孢素A血藥濃度，結(jié)果存在顯著差異，前者測定結(jié)果偏低[23-24]。但是崔彥等[25]對EMIT和FPIA測定環(huán)飽素A血藥濃度結(jié)果進行比較時，發(fā)現(xiàn)這兩種方法測定結(jié)果沒有統(tǒng)計學(xué)差異，EMIT結(jié)果偏低可能是由于實驗條件、操作等未標準化所致。研究結(jié)果表明，EMIT和HPLC[26-27]、MEIA（microparticle enzyme immunoassay）[28]、PETINIA（particle-enhanced turbidimetric inhibition immunoassay）[29]等方法檢測結(jié)果相關(guān)性較好、分析結(jié)果無顯著性差異。

心血管病藥物治療和中毒劑量接近，TDM可協(xié)助調(diào)整劑量，避免不良反應(yīng)發(fā)生。喬小云[30]等評價和控制了均相酶免疫法檢測患者地高辛血藥濃度的質(zhì)量，研究表明，在該實驗室條件下，日內(nèi)、日間質(zhì)控的相對標準偏差（RSD）均在2%～7%，平均回收率在97%～104%，證實了均相酶免疫法是監(jiān)測地高辛血藥濃度的一種較理想的測定方法。朱春香等[31]用HEIA法監(jiān)測患者地高辛血藥濃度，結(jié)果表明75歲以上患者平均濃度超過治療窗上限，同時應(yīng)注意維拉帕米、奎尼丁等合并用藥的影響。除監(jiān)測血藥濃度外，HEIA還能用于尿藥濃度測定，Wang等[32]采用該技術(shù)快速測定人體尿樣中芬太尼濃度，檢測限達1 ng·mL-1。目前HEIA用于臨床TDM的藥物見表1。

表1HEIA技術(shù)檢測的臨床TDM藥物

4 HEIA技術(shù)應(yīng)用于TDM需要注意的問題

HEIA技術(shù)提供了快速準確的血藥濃度測定結(jié)果，怎樣正確應(yīng)用該技術(shù)和檢測結(jié)果、制定合理的個體化給藥方案是TDM的關(guān)鍵。

（1）試劑存放。由于HEIA是基于酶促反應(yīng)，因此，溫度對體系活性影響較大。試劑保存溫度一般控制在2～8℃，溫度升高會影響酶標偶聯(lián)物活性和穩(wěn)定性。

（2）校正標準曲線。相對于普通生化試劑，HEIA試劑成分更加復(fù)雜，既有底物等化學(xué)試劑，又包含酶、抗體等一系列生物活性物質(zhì)，加之酶標偶聯(lián)物是通過化學(xué)偶聯(lián)制備，對酶的結(jié)構(gòu)已經(jīng)產(chǎn)生了一定破壞，因此，體系穩(wěn)定性會隨放置時間延長受到一定影響，及時定期校正標準曲線對確保檢測準確性至關(guān)重要。

（3）特殊藥物。相對于其他治療藥物檢測范圍，甲氨喋呤濃度變化較大，免疫試劑很難覆蓋整個檢測范圍，一些臨床樣本需要稀釋或選擇合適的標準曲線范圍檢測。為減少試劑消耗，選擇合適的稀釋倍數(shù)和標準曲線范圍，并盡量保證稀釋后的樣本濃度落在標準曲線中段尤為重要。骨科甲氨喋呤給藥一般為6 h滴注，劑量8 g，用藥量較大，若為用藥后24 h血樣，5～10倍稀釋后濃度約為1 μmol·L-1，即在標準曲線范圍內(nèi)適當位置；血液科給藥一般為24 h滴注，劑量3 g，48 h后樣本可直接檢測；中醫(yī)科等給藥量少的樣本可不稀釋，直接檢測。肝腎功能不全等特殊人群需再做相應(yīng)調(diào)整。

（4）特殊情況。HEIA監(jiān)測腎移植患者他克莫司的血藥濃度，結(jié)果顯示，女性患者血藥濃度高于男性，老年組血藥濃度顯著低于中、青年組，他克莫司給藥時應(yīng)注意性別、年齡等影響因素；聯(lián)合用藥時應(yīng)注意藥物相互作用的影響，采用EMIT監(jiān)測使用不同保肝藥的腎移植患者術(shù)后體內(nèi)環(huán)孢素濃度，結(jié)果表明，術(shù)后使用的大多保肝藥物均會影響環(huán)孢素血藥濃度，在合并用藥時應(yīng)予以關(guān)注；不同處方可能有不同的藥動學(xué)特征[33]，從靜注改為口服，或改用不同商品名藥物，都可能導(dǎo)致藥物濃度波動，發(fā)生不良反應(yīng)。同時TDM僅適用于血藥濃度與藥效定量關(guān)系相一致的藥物，例如有些藥物藥理作用持續(xù)時間比其在血中停留時間長得多，或不可逆地結(jié)合作用部位，這時TDM結(jié)果往往不能反映其療效。

5 展 望

HEIA技術(shù)具有靈敏度高、特異性強、準確性好、操作簡便、安全無污染，可實現(xiàn)自動化檢測等優(yōu)點，既可以測定小分子物質(zhì)，如藥物及激素（甲狀腺激素等[34]），又可以測定大分子物質(zhì)。但試劑大多依靠進口，依賴專用儀器，監(jiān)測成本高，患者經(jīng)濟負擔重。國內(nèi)自主研發(fā)的檢測試劑大大降低了成本，可改變以往依賴進口試劑和專用儀器、費用昂貴的現(xiàn)狀。隨著基因工程、酶工程等技術(shù)的發(fā)展，HEIA技術(shù)將得到進一步發(fā)展與應(yīng)用，例如肝功能指標（甘膽酸、總膽汁酸、透明質(zhì)酸），腎功能指標（肌酐），心血管功能指標（同型半胱氨酸），糖尿病指標（1，5-脫水-D-山梨醇），骨質(zhì)疏松標志物（脫氧吡啶酚）指標的檢測，還有望應(yīng)用于食品安全、毒品[35-36]、環(huán)境監(jiān)測[37-38]等更多領(lǐng)域。

傳統(tǒng)TDM需要患者用藥一段時間后測定血藥濃度，此時可能已發(fā)生藥效不佳或不良反應(yīng)，而目前進行監(jiān)測的藥物占臨床常用藥10%左右，藥物基因組學(xué)的發(fā)展使得基因分型可預(yù)測特定人群的藥物反應(yīng)，基因?qū)蚪Y(jié)合TDM指導(dǎo)臨床個體化用藥，可為患者提供更為安全、有效的給藥劑量，為推動TDM發(fā)展建立了新的研究平臺。

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Homogeneous Enzyme Immunoassay and Its Application in Therapeutic Drug Monitoring

QI Xie-min1,YU Liu-ming2,LI Dong2,ZHU Ting-ting1,CHU Xiao-man1*
1Department of Pharmacology,Jingling Hospital,Nanjing 210002,China;2Suzhou Evermed Biomedical Co.Ltd,Suzhou 215163,China

The Homogeneous Enzyme Immunoassay (HEIA)is a liquid competitive immunoassay.Detection methods developed based on this system are applied for testing of a variety of small molecules,such as therapeutic drugs and stimulants,as well as macromolecules successfully,while most depend on commercially imported kits.We are summarizing here the current research status,test principle and advantages of HEIA,especially its clinical applications in therapeutic drug monitoring(TDM) and issues that should be noticed in TDM.Further details on HEIA development and future utilizations for clinical testing are also discussed.Tests developed with this system are fast,specific and automated.This methodology can be widely used for TDM,while the commercially imported kits based on it are expensive with long delivery cycles.It is urgent to develop products with domestic independent intellectual property rights.

Homogeneous enzyme immunoassay;Therapeutic drug monitoring;Hapten;Open biochemistry analyzer system

R917

A

1673-7806（2015）01-047-04

齊謝敏，女，博士后，研究方向：藥物基因組學(xué)Tel:025-80860196 E-mail:qixiemin369@126.com

*通訊作者儲小曼，女，教授，主任藥師，研究方向：臨床藥理學(xué)與藥物基因組學(xué) E-mail:chuxm59@126.com

2014-09-17

2014-11-19