陰離子交換高效液相色譜法測(cè)定3-硝基鄰苯二甲酸中雜質(zhì)4-硝基鄰苯二甲酸、鄰苯二甲酸的含量

姚枝玉，吳秋娟，董 靜，李 薇，張 斐江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，南京 0008；江蘇先聲藥業(yè)有限公司，南京 004

陰離子交換高效液相色譜法測(cè)定3-硝基鄰苯二甲酸中雜質(zhì)4-硝基鄰苯二甲酸、鄰苯二甲酸的含量

姚枝玉1，吳秋娟2，董 靜2，李 薇2，張 斐2
1江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，南京 210008；2江蘇先聲藥業(yè)有限公司，南京 210042

目的：采用陰離子交換高效液相色譜法對(duì)3-硝基鄰苯二甲酸及其雜質(zhì)4-硝基鄰苯二甲酸、鄰苯二甲酸進(jìn)行色譜分離，并測(cè)定雜質(zhì)4-硝基鄰苯二甲酸、鄰苯二甲酸的含量。方法：SIELC Primesep D（4.6 mm×50 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相：0.01%H2SO4水溶液-乙腈，梯度洗脫；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：222 nm、226 nm、262 nm。采用雜質(zhì)外標(biāo)法對(duì)3-硝基鄰苯二甲酸樣品中4-硝基鄰苯二甲酸、鄰苯二甲酸進(jìn)行定量。結(jié)果：3種物質(zhì)在0.5 μg·mL-1~20 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好 （r>0.9995），檢測(cè)限分別為0.03 μg·mL-1、0.1 μg· mL-1、0.05 μg·mL-1。結(jié)論：該方法快速簡(jiǎn)便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，可用于兩雜質(zhì)的定量分析。

陰離子交換；3-硝基鄰苯二甲酸；4-硝基鄰苯二甲酸；鄰苯二甲酸

3-硝基鄰苯二甲酸 （3-Nitrophthalic acid，3-NPA）和4-硝基鄰苯二甲酸4-Nitrophthalic acid，4-NPA）是重要的有機(jī)合成中間體，可用于合成醫(yī)藥、染料、感光材料、農(nóng)作物保護(hù)劑等[1]，它們的制備通常先由鄰苯二甲酸（O-phthalic acid，O-PA）通過(guò)硝化反應(yīng)生成兩種硝基衍生物的混合物，再經(jīng)過(guò)分離得到[2]。在3-硝基鄰苯二甲酸中通常殘留有未分離完全的4-硝基鄰苯二甲酸、鄰苯二甲酸。因此實(shí)現(xiàn)對(duì)三者的分離和準(zhǔn)確定量有非常重要的意義。

3-硝基鄰苯二甲酸、4-硝基鄰苯二甲酸和鄰苯二甲酸均為疏水性較強(qiáng)的酸性物質(zhì)，在中性流動(dòng)相中易解離，導(dǎo)致以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱中保留較弱而不能被分離[3]。文獻(xiàn)報(bào)道，三者的分離主要是采用離子抑制色譜法，在流動(dòng)相中加入酸作為離子抑制劑，使溶質(zhì)以分子形式與固定相作用，從而實(shí)現(xiàn)分離[4]。該方法需要嚴(yán)格控制pH，條件苛刻且運(yùn)行時(shí)間較長(zhǎng)。本文采用陰離子交換高效液相色譜法，可快速、準(zhǔn)確地測(cè)定3-硝基鄰苯二甲酸中雜質(zhì)4-硝基鄰苯二甲酸和鄰苯二甲酸的含量，且有效縮短了分析時(shí)間，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1 儀器與試藥、試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀，二極管陣列檢測(cè)器（DAD），MiliQ去離子水發(fā)生器（美國(guó)Millipore公司）。

3-硝基鄰苯二甲酸 （安耐吉化學(xué)有限公司，批號(hào)SH0124、SH0328、SH0423）；4-硝基鄰苯二甲酸對(duì)照品（SIGMA-ALORICH，純度≥97.0%）；鄰苯二甲酸對(duì)照品（SIGMA-ALORICH，純度≥99.5%）。

乙腈（TEDIA,HPLC）；硫酸（南京化學(xué)試劑有限公司，AR）；純水（Milli-Q純水儀）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

2.1.1 供試品溶液 精密稱(chēng)量3-NPA 20 mg至20 mL量瓶中，加溶劑[0.01%H2SO4水溶液-乙腈=65∶35]適量，超聲10 min使溶解，放冷至室溫，定容，即為供試品溶液。

2.1.2 1%自身對(duì)照溶液 精密量取供試品溶液1 mL至100 mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，即為1%自身對(duì)照溶液。

2.1.3 雜質(zhì)對(duì)照品溶液 取雜質(zhì)4-NPA、O-PA對(duì)照品各約10 mg，精密稱(chēng)定，至同一20 mL量瓶中，加溶劑適量，超聲10 min使溶解，放冷至室溫，定容；精密量取1 mL至100 mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，即為對(duì)照品溶液，平行2份。

2.1.4 系統(tǒng)適用性溶液 取3-NPA，雜質(zhì)4-NPA、O-PA對(duì)照品各適量，加溶劑，超聲處理使溶解，并定量稀釋制成每1 mL中約含3-NPA 1 mg、4-NPA 10 μg和O-PA 10 μg的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液。

2.2 色譜條件

SIELC Primesep D（4.6 mm×50 mm，5 μm）陰離子色譜柱；流動(dòng)相：A-乙腈；B-0.01%H2SO4水溶液（精密量取硫酸0.1 mL置1000 mL水中，混勻即得），梯度洗脫（梯度程序見(jiàn)表1）；流速：1.0 mL· min-1；柱溫:30℃；紫外檢測(cè)器吸收波長(zhǎng)：222、226、262 nm；進(jìn)樣量：5 μL。在上述色譜條件中3-NPA的最大吸收波長(zhǎng)為222 nm，4-NPA的最大吸收波長(zhǎng)為262 nm，O-PA的最大吸收波長(zhǎng)為226 nm。分別在262 nm和226 nm波長(zhǎng)處按雜質(zhì)外標(biāo)法計(jì)算雜質(zhì)4-NPA及O-PA的含量，在222 nm波長(zhǎng)處按主成分自身對(duì)照法計(jì)算其他雜質(zhì)的含量。在上述條件下，鄰苯二甲酸、3-硝基鄰苯二甲酸和4-硝基鄰苯二甲酸的保留時(shí)間分別為1.48、1.96和4.18 min。系統(tǒng)適用性典型圖譜和3-NPA及其雜質(zhì)4-NPA、ONPA色譜圖見(jiàn)圖1～5。結(jié)果顯示：各成分之間分離度符合要求。

表1 梯度洗脫程序

圖1 系統(tǒng)適用性典型圖譜

圖2 供試品溶液色譜圖

2.3 方法學(xué)研究與驗(yàn)證

2.3.1 線性相關(guān)性 分別精密稱(chēng)取3-NPA，雜質(zhì)4-NPA、O-PA對(duì)照品各適量，用溶劑配制成濃度分別為0.5、1、3、5、10、20 μg·mL-1的雜質(zhì)對(duì)照品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。以濃度C（μg· mL-1）對(duì)峰面積A進(jìn)行線性回歸，得到3-NPA、4-NPA、O-PA分別在222、262、226 nm波長(zhǎng)下的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為A1=22.8292C+1.0581（r2=1.0000）；A2=11.5783C+0.0679（r2=1.0000）；A3= 12.8816C-0.0359（r2=1.0000）。結(jié)果表明三者在0.5～20 μg·mL-1（相當(dāng)于供試品溶液主成分濃度的0.05%～2%）濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖31 %自身對(duì)照溶液色譜圖

圖4 雜質(zhì)4-NPA對(duì)照品溶液色譜圖

圖5 雜質(zhì)O-NPA對(duì)照品溶液色譜圖

2.3.2 檢測(cè)限與定量限 取對(duì)照品適量，加溶劑配制成一定濃度的對(duì)照品溶液，按倍比稀釋法稀釋?zhuān)孕旁氡龋⊿/N）3∶1時(shí)相應(yīng)的濃度確定檢測(cè)限；以信噪比（S/N）為10∶1時(shí)相應(yīng)的濃度確定定量限。見(jiàn)表2。

表2 3-NPA、4-NPA、O-PA的檢測(cè)限及定量限

2.3.3 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下供試品溶液、1%主成分自身對(duì)照溶液、雜質(zhì)對(duì)照品溶液于室溫下不避光放置，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定，考察溶液穩(wěn)定性。雜質(zhì)對(duì)照品溶液中O-PA和4-NPA測(cè)定結(jié)果的RSD分別為0.80%、0.57%，供試品溶液中雜質(zhì)O-PA均未檢出，雜質(zhì)4-NPA及總雜檢出量的RSD分別為2.9%、1.9%。表明均在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性及中間精密度試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下平行配制6份供試品溶液及其1%主成分自身對(duì)照溶液，平行制備2份雜質(zhì)對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，考察方法重復(fù)性。結(jié)果表明，6份供試品中O-PA均未檢出，4-NPA及總雜的檢出量平均值分別為0.19%、0.33%，RSD分別為4.0%、4.3%，重復(fù)性好。變動(dòng)不同儀器、不同時(shí)間、不同人員作中間精密度試驗(yàn)，測(cè)得雜質(zhì)的量均一致，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.3.5 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液5 μL注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。3-NPA峰面積平均值為19789.3，RSD為0.08%，說(shuō)明進(jìn)樣精密度良好。

2.3.6 回收率試驗(yàn) 分別精密移取低、中、高不同體積的雜質(zhì)對(duì)照品溶液與供試品混合，配制為回收率試驗(yàn)低、中、高濃度的供試品溶液（各3份），其中O-PA和4-NPA的濃度分別為供試品3-NPA濃度（1 mg·mL-1）的0.2%、0.5%和0.8%。按“2.2 色譜條件”測(cè)定，每份溶液重復(fù)測(cè)定2次，計(jì)算回收率，驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 O-PA與4-NPA的回收率試驗(yàn)（n=9）

結(jié)果表明，低、中、高3水平的回收率良好，OPA的平均回收率為102.1%（RSD=0.58%，n=9），4-NPA的平均回收率為102.8%（RSD=1.0%，n=9）。

2.3.7 耐用性試驗(yàn) 分別考察柱溫變化±5℃、流速相對(duì)值變化±10%以及梯度時(shí)間變化±1 min測(cè)定時(shí)、儀器色譜行為變化。取供試品溶液、1%主成分自身對(duì)照溶液和雜質(zhì)對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣分析，按雜質(zhì)外標(biāo)法計(jì)算4-NPA、O-PA含量，按1%自身對(duì)照法計(jì)算未知雜質(zhì)含量。結(jié)果表明，各條件下各組分的峰均可達(dá)到基線分離，雜質(zhì)含量的絕對(duì)值之差在±0.05%以?xún)?nèi)，方法耐用性好。

2.3.8 樣品雜質(zhì)測(cè)定 按“2.1”方法配制各溶液。取供試品（批號(hào)：SH0124、SH0328和SH0423）溶液、雜質(zhì)對(duì)照品溶液、1%自身對(duì)照溶液及系統(tǒng)適用性溶液各5 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 雜質(zhì)測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明，三批供試品中O-PA均未檢出，4-NPA均小于0.5%，總雜質(zhì)（包括O-PA、4-NPA和未知雜質(zhì)）量均小于1%。

3 討 論

3.1 色譜柱選擇

SIELC Primesep D陰離子交換色譜柱為鍵合堿性離子對(duì)官能團(tuán)和烷基長(zhǎng)鏈的反相分析柱，其分離原理結(jié)合了疏水特性和離子交換雙重作用，對(duì)本文提到的這種酸性較強(qiáng)的物質(zhì)混合物具有非常好的分離作用。鄰苯二甲酸、3-硝基鄰苯二甲酸和4-硝基鄰苯二甲酸在該色譜柱上保留較強(qiáng)，峰型好，雜質(zhì)分離情況好，因此選用SIELC Primesep D陰離子交換色譜柱（4.6 mm×50 mm，5 μm）。同時(shí)，該色譜柱的使用需要與酸性較強(qiáng)的流動(dòng)相聯(lián)用，因此首先將流動(dòng)相鎖定為乙腈-0.1%H2SO4水溶液。

3.2 流動(dòng)相選擇

本實(shí)驗(yàn)中首先試用乙腈-0.1%H2SO4（50∶50）為流動(dòng)相，結(jié)果3-NPA與O-PA無(wú)法分離 （見(jiàn)圖6-A）。降低流動(dòng)相中乙腈的比例，保留時(shí)間變長(zhǎng)，分離效果變好（見(jiàn)圖6-B）。調(diào)整乙腈-0.1%H2SO4比例至15∶85時(shí)二者達(dá)到基線分離，但4-NPA出峰位置有未知雜質(zhì)干擾，且基線波動(dòng)大，峰拖尾（見(jiàn)圖6-C）。在各種梯度條件下，分離效果都不理想。

有機(jī)酸的保留主要受酸解離程度以及在固定相上離子交換能力的影響[5]。鄰苯二甲酸、3-硝基鄰苯二甲酸和4-硝基鄰苯二甲酸按酸性大小排列：鄰苯二甲酸<3-硝基鄰苯二甲酸<4-硝基鄰苯二甲酸。SIELC Primesep D色譜柱上鍵合了堿性離子對(duì)官能團(tuán)，降低流動(dòng)相中硫酸溶液的比例，則硫酸根離子減少，有機(jī)酸競(jìng)爭(zhēng)色譜柱上的堿性離子對(duì)官能團(tuán)的競(jìng)爭(zhēng)力增強(qiáng)，保留時(shí)間增大；同時(shí)減少流動(dòng)相中乙腈的比例，洗脫能力減小，保留時(shí)間增大，均有利于化合物分離。綜合考慮，將H2SO4溶液的濃度調(diào)整為0.01%，分離度得到明顯改善。當(dāng)乙腈-0.01% H2SO4水溶液的比例為35∶65時(shí)方法可用，等度條件下即可實(shí)現(xiàn)三者分離。調(diào)整梯度，使供試品中其他雜質(zhì)均洗脫。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)最后梯度條件確定為表1所得程序，進(jìn)樣結(jié)果如圖6-D。三種有機(jī)酸的分離度好，峰形對(duì)稱(chēng)，分析速度較快，線性關(guān)系和精密度良好。

圖6 流動(dòng)相選擇圖譜

3.3 溶劑選擇

3-NPA、4-NPA及O-PA在流動(dòng)相中溶解度均較好，且性質(zhì)穩(wěn)定；以流動(dòng)相為溶劑對(duì)雜質(zhì)測(cè)定無(wú)干擾，因此選擇流動(dòng)相（0.01%H2SO4水溶液-乙腈= 65∶35）為溶劑。

目前文獻(xiàn)中有關(guān)3-硝基鄰苯二甲酸、4-硝基鄰苯二甲酸、鄰苯二甲酸的同時(shí)分離的研究很少，同時(shí)其作為陰離子交換高效液相色譜法應(yīng)用的案例具有典型的特點(diǎn)。因此，本方法的建立較有意義。

[1] 崔小明.間苯二甲酸的生產(chǎn)、應(yīng)用及市場(chǎng)前景[J].精細(xì)石油化工進(jìn)展，2000，1（5）：44245.

[2] 董立文.間苯二甲酸國(guó)內(nèi)生產(chǎn)分析 [J].遼寧化工，2005，34（2）：78280.

[3] 趙景嬋，郭治安，常建華，等.有機(jī)酸類(lèi)化合物的反相高效液相色譜法的分離條件研究 [J].色譜，2001，19（3）：260-3.

[4] 練鴻振，王惟漢，李丹妮.3-硝基或4-硝基鄰苯二甲酸及其雜質(zhì)的高效液相色譜分析法：中國(guó)，200410065981.4[P].2005-06-29.http://dbpub.cnki.net/ Grid2008/Dbpub/Brief.aspx?ID=SCPD&subBase=all

[5] Fischer K,Bipp HP,Bieniek D,et al.Determination of monomeric sugar and carboxylic acids with ion-exclusion chromatography[J].J Chromatogr A,1995,706(1-2): 361-73.

Determination of 4-Nitrophthalic Acid and O-Phthalic Acid in 3-Nitrophthalic Acid by Anion Exchange High Performance Liquid Chromatography

YAO Zhi-yu1,WU Qiu-juan2,DONG Jing2,LI Wei2,ZHANG Fei2
1Jiangsu Institute for Food and Drug Control,Nanjing 210008,China;2Jiangsu Simcere Pharmaceutical Co., Ltd,Nanjing 210042,China

Objective:To establish a method to determine 4-nitrophthalic acid(4-NPA)and O-phthalic acid (O-PA)in 3-nitrophthalic acid (3-NPA)by anion exchange high performance liquid chromatography.Methods:A SIELC Primesep D column (4.6 mm×50 mm,5 μm)was used.The mobile phase consisted of 0.01%H2SO4solution and acetonitrile with gradient elution.The flow rate was 1.0 mL·min-1with the column temperature at 30℃.The injection volume was 5 μL.UV detection wavelength was set at 262 nm, 226 nm and 222 nm.The contents of O-PA and 4-NPA in samples were determined quantitatively by an external standard method.Results:The three substances in the scope of 0.5 μg·mL-1～20 μg·mL-1have good linear relations (r＞0.9995),the detection limit of 3-NPA,4-NPA and O-PA separately was 0.03 μg· mL-1,0.1 μg·mL-1and 0.05 μg·mL-1.Conclusion:The method is simple,accurate and suitable for the determination of 4-NPA and O-PA in 3-NPA.

Anion-exchange;3-Nitrophthalic acid;4-Nitrophthalic acid;O-Phthalic acid

R927.2

A

1673-7806（2015）01-030-04

姚枝玉，女，主管藥師 E-mail:cpuyao@sohu.com

2014-07-11

2014-10-31