EGCG對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、侵襲及VEGF蛋白表達(dá)的影響

陳萍 鄧守恒

EGCG對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、侵襲及VEGF蛋白表達(dá)的影響

陳萍 鄧守恒

目的研究表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對體外培養(yǎng)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響及其分子機制。方法采用MTT法檢測EGCG對宮頸癌細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞法檢測細(xì)胞凋亡及周期;細(xì)胞劃痕法和Transwell法檢測細(xì)胞體外侵襲;蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)水平。結(jié)果經(jīng)EGCG處理后，HeLa細(xì)胞的增殖和侵襲能力明顯受到抑制，凋亡率也顯著增高;隨著EGCG濃度升高，VEGF蛋白表達(dá)水平明顯下降。結(jié)論EGCG可通過下調(diào)VEGF蛋白表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞產(chǎn)生抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡和減弱侵襲等作用。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯;宮頸癌;血管內(nèi)皮生長因子

(The Practical Journal of Cancer，2015，30:961～963)

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是綠茶中含量最高，活性最強的單體［1］，研究顯示，EGCG具有顯著的清除氧自由基、抗氧化、抗衰老、防紫外線及預(yù)防心血管疾病等功效［2］。近年來，EGCG的抗腫瘤作用逐漸引起了人們的重視，EGCG可通過多種途徑對肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、肝癌和鼻咽癌等產(chǎn)生殺傷作用，有望開發(fā)成一種抗腫瘤新藥［3］，有關(guān)EGCG對宮頸癌的作用目前報道較少，本文對此進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1．1 藥物試劑與儀器

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、噻唑喃(MTT)、碘化丙啶(PI)為美國Sigma產(chǎn)品;Transwell小室購自美國Costar公司;VEGF鼠抗人單克隆抗體為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品;Mod 550型全自動酶標(biāo)儀為美國Bio－Rad公司產(chǎn)品;Epics Elite ESP型流式細(xì)胞儀為美國Coulter公司產(chǎn)品。

1．2 CCK－8法檢測細(xì)胞增殖

人宮頸癌HeLa細(xì)胞株由本院臨床醫(yī)學(xué)研究所提供，培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基內(nèi)，于37℃、飽和濕度，5%CO2條件下培養(yǎng)，每2～3 d用0．25%胰酶消化，1∶2傳代，取指數(shù)生長期HeLa細(xì)胞，以1×104個/ml接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后吸出原培養(yǎng)液，加入含不同濃度EGCG的RPMI 1640培養(yǎng)基，使每孔終濃度分別為0、5、10、20、40、80、160 mg/ L，每組設(shè)5個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，吸去上清液，每孔加入5 mg/ml MTT試劑10 μl，作用2 h后棄去上清液，150 μl二甲基亞砜作用30 min，在570

nm波長下讀取各孔吸光度A值，計算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率=(對照組吸光度－藥物組吸光度)/對照組吸光度×100%。

1．3 流式法檢測細(xì)胞周期及凋亡

收集經(jīng)0、5、10、20、40 mg/LEGCG處理48 h的各組細(xì)胞，0．01 mol/L PBS0．5 ml重懸細(xì)胞，加70%乙醇1 ml，－20℃固定24 h，加入PI(終濃度為50 μl/ml)和RNA酶(終濃度為0．25 mg/ml)，室溫下避光孵育30 min后流式細(xì)胞儀作DNA分析，以ModFit LT軟件分析，擬合計算各時相細(xì)胞百分比。

1．4 細(xì)胞遷移檢測［4］

［4］將細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中24 h后去除培養(yǎng)液，用10 μl移液器槍頭沿培養(yǎng)孔底部輕劃一條劃痕，用無血清培養(yǎng)液洗滌后更換含1%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，再換含10%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察劃痕區(qū)細(xì)胞的遷移情況。

1．5 Transwell法檢測細(xì)胞侵襲性改變

細(xì)胞分組及處理同1．3，以NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)液做趨化液，在Transwell上室內(nèi)加入100 μl不含小牛血清的RPMI 1640，37℃孵育1 h，加入上述各組細(xì)胞懸液20 μl(調(diào)細(xì)胞濃度為1．0×105個/ml)，每組4個復(fù)孔。37℃12 h后取出濾膜，甲醇固定，HE染色。顯微鏡下計數(shù)濾膜外表面的細(xì)胞數(shù)，每張濾膜隨機取5個視野(×200)取均值，相對侵襲抑制率(%)=(對照組－實驗組)/對照組×100%。

1．6 免疫印跡法檢測VEGF蛋白表達(dá)

細(xì)胞分組及處理同1．3，消化收集細(xì)胞，PBS洗2次，裂解，離心，收集上清，即為細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行蛋白定量，調(diào)節(jié)每份樣品蛋白濃度，加等量蛋白于上樣緩沖液，煮沸，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后轉(zhuǎn)膜，依次加入VEGF蛋白一抗和二抗，加入底物液顯色，拍照。蛋白條帶用Quanti Scan軟件進(jìn)行密度掃描分析。

1．7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)采用±s表示。組間數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析(oneway ANOVA)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 EGCG對細(xì)胞增殖的抑制作用

0～160 mg/L等7個濃度的EGCG分別作用于體外培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞24、48、72 h，可對細(xì)胞增殖產(chǎn)生明顯的抑制作用，呈現(xiàn)出一定的時間和劑量依賴關(guān)系。作用24、48、72 h的半數(shù)抑制濃度IC50分別為130．2、 33．4、21．7 mg/L(圖1)。

圖1 EGCG對HeLa細(xì)胞增殖的影響

2．2 EGCG對細(xì)胞周期分布、凋亡率的影響

在2．1篩選結(jié)果基礎(chǔ)上，采用0、10、20、40 mg/L EGCG處理HeLa細(xì)胞48 h用于檢測細(xì)胞凋亡及周期分布改變，結(jié)果顯示，未經(jīng)藥物處理的空白對照細(xì)胞凋亡率很低，僅為(0．7±0．1)%，經(jīng)上述濃度EGCG作用48 h，細(xì)胞凋亡率則明顯升高，與對照組比較，均有顯著性差異(P＜0．05，P＜0．01)。細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，EGCG能夠增加G1期細(xì)胞比例，降低S期細(xì)胞比例，EGCG劑量越大上述效果越明顯(P＜0．05，P＜0．01)，說明EGCG可通過阻滯HeLa細(xì)胞于G1期誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(表1)。

表1 EGCG對HeLa細(xì)胞凋亡及周期分布的影響(±s，%，n=4)

表1 EGCG對HeLa細(xì)胞凋亡及周期分布的影響(±s，%，n=4)

與對照組比較，*為P＜0．05，＊＊為P＜0．01。

EGCG/mg·L－1凋亡率G1S M 6．2±1．3 00．7±0．145．1±2．243．2±1．17．7±1．1 102．9±0．2*50．5±2．1*41．3±1．89．7±1．3 2010．1±0．6*54．8±1．7*39．6±2．15．4±0．5 4018．2±1．8＊＊59．3±2．4*33．8±2．7*

2．3 EGCG對細(xì)胞遷移及侵襲的影響

接種培養(yǎng)板48 h后熒光顯微鏡下可見，與未經(jīng)藥物處理組比較，經(jīng)5、10、20、40 mg/L EGCG作用后的HeLa細(xì)胞進(jìn)入劃痕區(qū)的數(shù)目明顯減少，EGCG濃度越高上述現(xiàn)象越明顯。細(xì)胞侵襲實驗也顯示出相似的作用結(jié)果，EGCG作用后的實驗組細(xì)胞侵襲人工基底膜后，不僅在細(xì)胞數(shù)量上明顯低于空白對照組，而且還表現(xiàn)出形態(tài)各異的偽足(表2)。

2．4 EGCG對細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)的影響

免疫印跡及灰度掃描結(jié)果顯示，未經(jīng)處理的空白對照HeLa細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白呈高表達(dá)(灰度值為1．073±0．26)。經(jīng)5、10、20、40 mg/L EGCG作用48 h

后，細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白灰度值分別降至(0．901± 0．03)、(0．351±0．03)、(0．232±0．02)和(0．103± 0．02)，下調(diào)率分別為(14．7±2．1)%、(50．3± 2．1)%、(77．3±3．2)%和(88．5±2．3)%，與空白對照組比較，除5 mg/L EGCG下調(diào)效果未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)差異外(P＞0．05)，其余組均具有顯著性差異(圖2)。

表2 EGCG對HeLa細(xì)胞遷移及侵襲的影響(±s，n=4)

表2 EGCG對HeLa細(xì)胞遷移及侵襲的影響(±s，n=4)

與對照組比較，*為P＜0．05，＊＊為P＜0．01。

EGCG(mg/L)細(xì)胞數(shù)目抑制率/% 0 162±20*18．5±2．1*10117±15＊＊36．1±3．7＊＊2086±11＊＊48．2±4．1＊＊4063±7＊＊61．5±3．3 210±16 5＊＊

圖2 EGCG對HeLa細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)的影響

3 討論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，近年來其發(fā)病呈年輕化的趨勢。失控性增殖和凋亡受阻是包括宮頸癌在內(nèi)的惡性腫瘤的重要特征，而許多抗腫瘤藥物也正是通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖和(或)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡產(chǎn)生作用。我們將綠茶中的主要成份EGCG作用于體外培養(yǎng)的宮頸癌HeLa細(xì)胞株，采用MTT法檢測了其對細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGCG可明顯抑制細(xì)胞增殖，且呈一定的時間和劑量效應(yīng)關(guān)系。采用流式細(xì)胞儀做DNA倍體分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)10、20、40 mg/L EGCG作用48 h，宮頸癌細(xì)胞凋亡率隨藥物濃度加大而增加，S期細(xì)胞數(shù)量顯著減少，細(xì)胞周期被明顯阻滯于G1期，這與宋巖巖等［5］采用形態(tài)學(xué)檢測等方法在宮頸癌和其他腫瘤細(xì)胞上觀察的EGCG作用結(jié)果相一致［6］，推測原因可能是由于細(xì)胞增殖的速度主要取決于細(xì)胞周期的長短，而細(xì)胞周期的長短又主要取決于G1期，EGCG通過阻滯細(xì)胞于G1期從而使細(xì)胞增殖周期延長，導(dǎo)致部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡［7］。

具有局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤另一重要的特征，也是惡性腫瘤致人死亡的主要原因，是惡性腫瘤的另一重要生物學(xué)行為。我們分別采用細(xì)胞劃痕法和Transwell法對細(xì)胞侵襲能力進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示經(jīng)EGCG作用后的宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力也明顯受到抑制，表現(xiàn)為經(jīng)EGCG作用后的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入劃痕區(qū)和穿過基底膜的能力大大下降，數(shù)量明顯減少。

VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長因子(heparin－binding growth factor)，可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生，是腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的重要細(xì)胞因子。大量研究表明［8－9］，在包括宮頸癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞中，VEGF的過表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的凋亡抵抗、侵襲轉(zhuǎn)移及對化療藥物的多藥耐藥等有關(guān)。本研究顯示EGCG還可明顯下調(diào)VEGF的表達(dá)，說明EGCG對宮頸癌細(xì)胞產(chǎn)生的抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡、降低侵襲和轉(zhuǎn)移等作用與下調(diào)細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白有關(guān)。但由于EGCG是1種多靶點的抑制劑，其對宮頸癌細(xì)胞的作用機制及靶點還遠(yuǎn)未闡明，尚需進(jìn)行深入研究。

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Effect of EGCG on Proliferation、Invasion and VEGF Expression of Human Cervical Carcinoma HeLa Cells

CHEN Ping，DENG Shouheng．People＇s Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine，Shiyan，442000

ObjectiveTo study the effect of epigallocatechin－3－gallate(EGCG)on proliferation，apoptosis and invasion of human cervical carcinoma HeLa cells，and its mechanism．MethodsThe effect of EGCG on proliferation of HeLa cells was detected by MTT method and．Cell apoptosis and cell cycle were detected by the flow cytometry．Cell invasive ability was measured by cell scratch assay and Transwell method．The expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)was detected by western blot．ResultsEGCG could inhibit cell proliferation and invasion，and increase cell apoptosis of HeLa cells in a dose－dependent manner and the level of VEGF was markedly suppressed by EGCG．ConclusionEGCG can suppress the proliferation，induce apoptosis and decrease invasion of HeLa cells by down－regulating the expression of VEGF．

Epigallocatechin－3－gallate(EGCG);Cervical carcinoma;Vascular endothelial growth factor(VEGF)

10．3969/j．issn．1001－5930．2015．07．004

R737．33

:A

:1001－5930(2015)07－0961－03

2014－10－10

2015－02－26)

(編輯:吳小紅)

湖北省教育廳項目(編號:B20122413)

442000湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院腫瘤中心

鄧守恒