HPLC測定血清中丙戊酸濃度質控方法的研究

袁孔現　毛名揚　詹三華

HPLC測定血清中丙戊酸濃度質控方法的研究

袁孔現毛名揚詹三華

【摘要】目的建立使用HPLC測定血清中丙戊酸濃度的質控方法，保證監測的準確性和可靠性。方法使用含丙戊酸質控血清，與患者血清同步測定，比照兩者測定結果計算患者血清中丙戊酸濃度。結果含丙戊酸質控血清穩定性良好，日內、日間RSD均小于6．0%，回收率為96．0%～106．2%，有效保證血樣中丙戊酸濃度的監測。結論

使用質控血清參照法測定丙戊酸血清濃度方法快速、簡便、準確性好，可靠性高，適用于臨床進行丙戊酸的治療藥物監測。

【關鍵詞】丙戊酸;藥物監測;質量控制;高效液相色譜法

作者單位: 244000安徽省銅陵市人民醫院

丙戊酸是一種結構與卡馬西平、苯妥英、苯巴比妥不相關的不含氮的抗癲癇藥物，化學名稱為2-丙基戊酸，1881年合成，最初被作為有機溶劑使用，1963年肯定其具有抗癲癇作用。目前丙戊酸也被用于各種精神疾病和偏頭痛的治療，丙戊酸的治療反應通常在血清濃度達到或大于40 mg/L時出現，當血清濃度超過100 mg/L時就能發生藥物中毒［1］。丙戊酸治療濃度窗口較窄，體內過程和療效個體差異較大，進行治療藥物監測能夠最大程度控制病情，減少藥物不良反應的發生。對于血液樣本的準確測定能為判斷分析療效及制定個體化給藥方案提供可靠依據，使用質控血清進行監測參照能夠有效保證血液樣本測定的準確性，減少單次測定時頻繁加樣帶來的誤差。

1　材料與試劑

1．1儀器高效液相色譜儀，包括四元泵LC-20AD、在線脫氣機DGU-20A5、紫外檢測器SPD-20AV、柱溫箱CTO-20A、HPLC色譜工作站(日本島津公司)。MDF-382E超低溫冰箱(日本三洋)，萬分之一電光分析天平(上海儀器廠)。

1．2試劑丙戊酸鈉對照品(江蘇恒瑞制藥廠提供，批號: 20080611，99．2%)、特級新生牛血清(蘭洲民海生物工程有限公司，批號: 20100310)、環已烷羧酸( Geel，Belgium，Lot: A010002801，98 + %)、2-溴苯乙酮( Geel，Belgium，Lot: A017996101，98%) ;甲醇、乙腈、正戊烷均為色譜純(美國TEDIA公司)，三乙胺為化學純，試驗用水為實驗室自制重蒸餾水。

2　方法與結果

2．1色譜條件色譜柱Kromasil 100A C18 ( 150 mm LD×4．6 mm ID，5 μm) ;流動相:乙腈－試驗用水( 70∶30，v∶v) ;檢測波長: 248 nm;流速: 1．0 ml/min;柱溫: 40℃;進樣量: 20 μl。定量方法:內標－峰面積積分法。

2．2試液的制備VPA質控血清精密稱取48．00 mg 經105℃干燥恒重的丙戊酸鈉對照品置25 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成含丙戊酸1 659 mg/L的標準溶液。溶解均勻后精密吸取5．0 ml 置100 ml容量瓶中，水浴蒸去大部分甲醇，加特級新生牛血清至刻度，充分溶解均勻后即制得含VPA 82．96 mg/L的質控血清，分裝成1 ml小包裝后密封冷凍備用。內標及衍生試劑精密稱取12．5 mg環已烷羧酸置100 ml容量瓶中，加乙腈至刻度，配制成125．0 mg/L的環已烷羧酸/乙腈內標溶液;精密稱取100．0 mg的2-溴苯乙酮置100 ml容量瓶中，加乙腈至刻度，配制成1．0 g/L的2-溴苯乙酮/乙腈衍生試劑; 取20 ml三乙胺，加80 ml乙腈配制成20%的三乙胺/乙腈( v∶v)溶液為反應催化劑。所用試劑配制后置4℃冰箱中避光冷藏保存備用。

2．3血樣處理和色譜行為取出冷凍質控血清，自然解凍至室溫，精密吸取100 μl，加入內標溶液50 μl、1 mol/L硫酸50 μl，混勻;加入正戊烷4 ml，渦旋提取1 min，靜置5 min，轉移上清液至潔凈玻璃管中，加1．0 g/L的2-溴苯乙酮/乙腈衍生試劑50 μl、催化劑20%三乙胺/乙腈溶液50 μl，置60～65℃水浴中避光反應10 min，N2吹干。殘渣用100 μl乙腈溶解，取20 μl溶液進樣。環已烷羧酸衍生物峰值時間為3．980 min、丙戊酸衍生物峰值時間為6．040 min。兩者丙戊酸和內標色譜峰分離良好，峰形正常，較少拖尾，完全達到基線分離，患者血清色譜圖中出現的雜質峰不影響主峰的積分計算。見圖1。

2．4樣品丙戊酸濃度依據患者血清圖譜中丙戊酸衍生物峰與內標衍生物峰積分值的比值，參照質控血清圖譜中兩峰值比及質控血清中丙戊酸濃度計算患者

血清中丙戊酸濃度。

圖1　HPLC色譜圖

2．5方法學考察

2．5．1精密度試驗:取空白血清100 μl×1份，精密加入丙戊酸標準溶液5 μl，另取質控血清樣本100 μl ×3份，按“2．3項”步驟檢測，以加樣血清樣本為基準，計算質控血清樣本內丙戊酸濃度，取平均值，計算日內精密度;在同一周內，每天測定1次，連續測定5 d，計算日間精密度。結果日內、日間的RSD值均小于6．0%，回收率為96．6%～106．2%。

2．5．2標準曲線繪制:精密吸取空白血清100 μl，加入丙戊酸標準溶液，配制成濃度梯度為8．30、16．59、33．18、66．37、132．74 mg/L的含丙戊酸血清樣本。按2．3項操作，參照質控血清測算樣本中丙戊酸濃度，以標準溶液質量濃度( X)為橫坐標、實際測得加樣血清中丙戊酸濃度( Y)為縱坐標，得回歸方程Y = 0．9543 X－1．2959，r = 0．9994。結果表明，使用質控血清參照，血清丙戊酸濃度在8．30～132．74 mg/L范圍內線性關系良好，測量結果準確。

2．5．3穩定性試驗:將質控血清反復冷凍(－20℃)、解凍，按“2．3項”步驟處理，與新鮮配制的加樣血清進行比對，結果顯示質控血清在反復凍融期間穩定性良好。

2．5．4專一性試驗:考慮到臨床治療過程中，合用藥物有可能對本試驗結果產生干擾，在擬訂血樣處理方法和色譜條件下，對幾種在治療癲癇時可能合用的藥物，如卡馬西平、苯妥英鈉、地西泮、硝西泮、苯巴比妥等進行分析比較。結果這些藥物在同等條件下出峰位置靠前，大約在3 min內完成出峰，如卡馬西平出峰時間為1．82 min，地西泮出峰時間為2．69 min。對丙戊酸衍生物和內標衍生物出峰位置無干擾，不影響丙戊酸血藥濃度的測定。

2．6樣品測定使用質控血清對臨床科室提供的30份患者血清樣本進行即時測定，其中丙戊酸濃度低于40 mg/L的有6份，處于40～100 mg/L正常治療濃度范圍的有21份，高于100 mg/L的有3份。丙戊酸藥物濃度監測有效地協助臨床醫師及時調整治療方案，保證治療效果，防止藥物不良反應的發生。

3　討論

文獻報道的方法大都采用標準溶液臨時加樣法，標準溶液在使用過程中容易吸濕或溶劑蒸發，冷藏期間也會發生降解，需要經常性進行標定或重新配制，難以保證檢測的穩定性和準確性［2，3］。使用冷凍質控血清對患者血樣進行檢測，由于冷凍質控血清穩定性較高［4］，能有效保證血樣檢測的準確性和可靠性。

丙戊酸分子結構中不含紫外特征吸收基團，不能用高效液相色譜－紫外檢測法直接測得，對其結構進行衍生化反應，在有機酸基團上接入有紫外吸收的2－溴苯乙酮基團進行檢測是本法的關鍵，也是選擇環已烷羧酸作為內標物的基礎，兩者結構相近，化學性質基本相同。

實驗所用的試劑保存期間需特別注意，所用試劑溶液均需避光、冷藏保存，包括1 mol/L稀硫酸溶液，在我實驗室長期檢測工作中，發現稀硫酸在室外光照情況下會產生雜質，檢測時出現異常峰，干擾試驗結果。2-溴苯乙酮溶液在光照的情況下會迅速降解，降低衍生反應程度，嚴重影響檢測效果。

文獻報道衍生反應溫度為50～55℃［2，3］，本實驗采用60～65℃水浴中完成衍生反應，相比較發現升高反應時溫度會改善反應效率，使丙戊酸衍生物和環已烷羧酸衍生物的響應值提高。在夏天氣溫高時，衍生反應結束、N2吹干后，可用自來水沖淋試管外壁，以期迅速降低試管溫度，避免在自然降溫情況衍生產物發生降解，影響檢測結果。

流動相使用乙腈－實驗用水( 70∶30，v∶v)，用乙腈替代甲醇［5］。由于乙腈的黏度低于甲醇，可以減小實驗過程中產生的液壓，降低實驗設備負荷。也可以通過調整乙腈－實驗用水的比例來適應色譜分析柱和修正圖譜峰形，當換用250 mm色譜柱時可增加流動

相中乙腈比例，以確保單組分析在10 min內完成。

在日常檢測工作中我們發現，成人使用丙戊酸鈉緩釋片(德巴金，500 mg/片)口服，1～2次/d，能很好地控制藥物治療濃度和病情，而小兒使用的丙戊酸鈉溶液劑(德巴金)，1～2次/d不能有效控制病情，服藥期間藥物濃度峰-谷差值較大，容易出現嗜睡(峰值時)和病情發作(谷值時)的情況。究其原因，丙戊酸鈉緩釋片在胃內僅少量釋放，在腸道內緩慢吸收，達峰時間較長，峰濃度較低，峰-谷差值較小。而丙戊酸鈉溶液劑口服后在胃內迅速吸收，1 h內達峰值，生物利用度近100%［6］。因此建議小兒在使用丙戊酸鈉溶液劑(德巴金)時，可將每日總劑量分3～4次服用，嚴格掌握用藥劑量和時間間隔，以期降低丙戊酸峰濃度，最大程度控制病情，減少藥物不良反應和峰-谷濃度差。

參考文獻

1Amitava Dasgupta主編，陸林譯．藥物監測方法·治療性用藥與藥物濫用．第1版．北京:人民衛生出版社，2011．13．

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4鄧述歡，楊麗珍，馮潔儀．兩種不同密封方法保存冰凍質控血清效果的對比．檢驗醫學與臨床，2011，8: 2644．

5張偉東，馬金秋，王娜．RP-HPLC法測定人血清中丙戊酸濃度及在癲癇患兒中的應用．中國藥房，2013，24: 1673．

6張象麟主編．藥物臨床信息參考．第1版．重慶:重慶出版社，2008．1124．

·藥物研究·

收稿日期:( 2014－09－09)

doi:10．3969/j．issn．1002－7386．2015．04．054

【中圖分類號】R 917

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002－7386( 2015) 04－0613－03