外周血β－HCG mRNA表達與妊娠滋養細胞腫瘤血行轉移的相關研究

范思斯 潘 玫 秦海燕 鄭 芳

外周血β－HCG mRNA表達與妊娠滋養細胞腫瘤血行轉移的相關研究

范思斯 潘 玫 秦海燕 鄭 芳

目的研究妊娠滋養細胞腫瘤患者外周血β－HCG mRNA表達情況，評價其表達與不同臨床指標的關系。方法收集28例妊娠滋養細胞腫瘤、15例葡萄胎、10例正常妊娠婦女和10例非妊娠婦女外周血。運用外周血密度梯度離心法提取單個核細胞和滋養細胞后采用RT－PCR方法檢測四者β－HCG mRNA表達水平，并與妊娠滋養細胞腫瘤臨床指標做相關分析。結果10例非妊娠婦女外周血β－HCG mRNA表達均陰性，10例正常妊娠婦女外周血中3例見β－HCG mRNA擴增條帶，15例葡萄胎患者外周血中8例見β－HCG mRNA擴增條帶，28例妊娠滋養細胞腫瘤患者外周血中24例見β－HCG mRNA擴增條帶，正常妊娠婦女β－HCG mRNA表達水平低于葡萄胎、妊娠滋養細胞腫瘤患者(P＜0．05)。妊娠滋養細胞腫瘤患者外周血β－HCG mRNA表達與治療前血β－HCG水平、肺轉移及臨床分期有關(P＜0．05)。28例隨訪病例中只有1例進展，無復發病例。結論外周血中單個核細胞不表達β－HCG mRNA。正常妊娠、葡萄胎及妊娠滋養細胞腫瘤均有滋養細胞脫落入血。外周血滋養細胞β－HCG mRNA可能成為評估妊娠滋養細胞腫瘤早期血行轉移的有效指標。

妊娠滋養細胞腫瘤;β－HCG;密度梯度離心法;逆轉錄－聚合酶鏈反應

(The Practical Journal of Cancer，2015，30:806～811)

本研究擬采用密度梯度離心和RT－PCR技術檢測妊娠滋養細胞腫瘤患者外周血中β－HCG mRNA表達，評價其表達與不同臨床指標的關系，尋找早期診斷妊娠滋養細胞腫瘤血行轉移的標志物，以期合理治療及預測預后。

1 材料與方法

1．1 一般資料

收集江西省婦幼保健院2013年4月－10月入院的28例初治侵蝕性葡萄胎或妊娠性絨毛膜癌，經血β－HCG檢測、B超、胸片或病理學確診;除外既往有乳腺癌、肺癌等上皮性癌病史者及非妊娠性絨毛膜癌者。患者年齡16～45歲，平均年齡27歲。前次妊娠葡萄胎16例，非葡萄胎12例。前次妊娠至確診間隔時間為1～16個月。臨床表現為陰道不規則出血20例，大出血2例，月經紊亂1例，下腹痛5例，咳嗽3例，惡心、嘔吐4例，無癥狀僅表現為血β－HCG異常者3例。肺CT示大小不等(0．21～3．54 cm)結節影22例。治療前血β－HCG(mIU/ml)＜1033例，≥103～10410例，＞104～10514例，＞1051例。解剖學分期:Ⅰ期5例，Ⅱ期1例，Ⅲ期22例，Ⅳ期0例，改良FIGO預后評分低危21例，高危7例。28例侵蝕性葡萄胎或妊娠性絨毛膜癌患者中24例接受2～10個療程化療，平均療程5個;1例仍在化療中，1例因肺結核轉院治療，2例中途拒絕治療。化療方案:(1)單藥氟尿苷;(2)雙藥FA:氟尿苷+更生霉素;(3)三藥FAV:長春新堿+氟尿苷+更生霉素;(4)EMA－CO:甲氨蝶呤+依托泊苷+更生霉素/長春新堿+異環磷酰胺。24例患者綜合治療后21例(87．5%)獲完全緩解，3例(12．5%)部分緩解(殘留肺部病灶);6例耐藥。另取15例葡萄胎患者、10例正常妊娠婦女及10例非妊娠婦女作為對照組。

1．2 試劑與引物設計

人外周血淋巴細胞分離液(FICOLL配制)，購自天津市灝洋生物制品科技有限公司。RNAiso plus、PrimeScriptTMRT－PCR Kit(RR014A)、50 bp DNA marker，購自大連寶生物公司。β－HCG和GAPDH mRNA引物，購自南京金斯瑞生物科技有限公司。β－HCG和內參基因GAPDH mRNA引物設計參考有關文獻［1］，并經BLAST驗證。β－HCG上游引物:TACTGCCCCACCATGACC，下游引物:CACGGCGTAGGAGACCAC;產物大小為144 bp。GAPDH上游引物:AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，下游引物:AGGGGCCATCCACAGTCTTC;產物大小為258 bp。

1．3 標本采集與總RNA提取

采集化療前侵蝕性葡萄胎或妊娠性絨毛膜癌患者、清宮前葡萄胎患者、正常孕2～3月妊娠婦女及非妊娠婦女EDTA抗凝血4 ml。淋巴細胞分離液分離單個核細胞和滋養細胞。RNAiso plus抽提細胞總RNA，具體操作按說明書進行。美國伯樂分光光度儀測OD260 nm/OD280 nm比值判斷RNA純度，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。

1．4 RT－PCR

合成cDNA第一鏈:①dNTP Mixture(10 mM each)1 μl，Oligo dT Primer(2．5 μM)和Random 6 mers (20 μM)各0．5 μl，模板RNA 1 μg，無核酶水補足10 μl;置恒溫水浴鍋65℃5 min，4℃。②上述反應液10 μl，5×PrimerScript Buffer 4 μl，RNase Inhibitor(40 u/μl)0．5 μl，PrimeScript RTase 0．5 μl，無核酶水，5 μl;共20 μl體系。置PCR儀30℃10 min，42℃15 min，95℃5 min，4℃。PCR反應:①10×PCR Buffer II 2 μl，dNTP Mixture(10 mM each)0．8 μl，上游引物0．2 μl，下游引物0．2 μl，Takara Ex Taq HS(5 u/μl) 0．2 μl，上述反轉錄反應液2 μl，無核酶水補足20 μl。②PCR反應以95℃預變性10 min;95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃1 min，β－HCG 33循環和GAPDH 29循環，4℃。③取5 μl PCR液和1 μl 6×DNA上樣緩沖液混勻后上樣于3%瓊脂糖凝膠，另取5 μl 50 bp DNA marker上樣，1×TAE電泳緩沖液中180 V電泳20 min，EB染色10 min后凝膠成像系統下觀察并保存，以出現144 bp擴增條帶為陽性。使用Quantity one V4．62測定條帶灰度值，以β－HCG mRNA和GAPDH mRNA的灰度比值對β－HCG mRNA進行相對定量分析。④設空白對照、陰性對照和陽性對照，空白對照為不加RNA模板，陰性對照為不加RT酶，陽性對照為清宮術后的葡萄胎組織。每次實驗重復3次。

1．5 隨訪

采用門診復診和電話隨訪相結合的方式。起始事件為診斷妊娠滋養細胞腫瘤，終點事件為腫瘤進展或復發，觀察指標為無進展生存期及無疾病生存期。隨訪截止時間為2014年4月，以月為計算單位。

1．6 統計學分析

應用SPSS 19．0軟件進行統計學分析。比較各組β－HCG mRNA表達水平，采用Kruskal－Wallis H檢驗，兩兩比較采用秩變換后SNK檢驗。比較妊娠滋養細胞腫瘤β－HCG mRNA在不同臨床參數組的表達情況，采用Fisher確切概率法。顯著性水平α=0．05。

2 結果

2．1 總RNA鑒定

OD260 nm/OD280 nm比值為1．7～2．0，1%瓊脂糖凝膠電泳EB染色可見18 S和28 S 2條亮帶，且28 S條帶亮度大約是18 S的2倍(圖1)。

2．2 外周血β－HCG mRNA表達情況

10例非妊娠婦女外周血β－HCG mRNA表達均陰性(見圖2)。10例正常妊娠婦女外周血中3例肉眼可見β－HCG mRNA擴增條帶，條帶亮度較陽性對照弱(見圖3)，β－HCG mRNA和GAPDH mRNA的灰度比值范圍為0．01～0．77。15例葡萄胎患者外周血中8例肉眼可見β－HCG mRNA擴增條帶，條帶亮度不等，較陽性對照弱，(見圖4)，β－HCG mRNA和GAPDH mRNA的灰度比值范圍為0．02～3．56。28例妊娠滋養細胞腫瘤患者外周血中24例肉眼可見β－HCG mRNA擴增條帶，條帶亮度不等，較陽性對照弱(見圖5、6)，β－HCG mRNA和GAPDH mRNA的灰度比值范圍為0．04～4．56。本組中正常妊娠婦女β－HCG mRNA表達水平低于葡萄胎、妊娠滋養細胞腫瘤患者(P＜0．05)，但葡萄胎與妊娠滋養細胞腫瘤患者β－HCG mRNA表達水平差異無統計學意義(P＞0．05)。

2．3 妊娠滋養細胞腫瘤患者外周血β－HCG mRNA表達與臨床參數的關系

妊娠滋養細胞腫瘤患者外周血β－HCG mRNA表達與治療前血B－HCG水平、肺轉移及臨床分期有關，P＜0．05;而與年齡、前次妊娠、距前次妊娠時間、最大腫瘤大小、預后評分、耐藥、化療療程及化療療效均無關(P＞0．05)。見表1。

表1 妊娠滋養細胞腫瘤患者外周血β－HCG mRNA表達與臨床參數的關系

2．4 妊娠滋養細胞腫瘤患者外周血β－HCG mRNA表達與預后的關系

28例妊娠滋養細胞腫瘤患者無失訪病例，隨訪時間為6～12個月。28例妊娠滋養細胞腫瘤患者中1例因化療5個月后出現肺部新病灶判定為腫瘤進展，現仍在化療中。該病例外周血β－HCG mRNA擴增條帶陽性，β－HCG mRNA和GAPDH mRNA的灰度比值為4．16，為28例妊娠滋養細胞腫瘤患者中β－HCG mRNA和GAPDH mRNA的灰度比值第二高者(最高者比值為4．56)。28例妊娠滋養細胞腫瘤患者中只觀察到1例腫瘤進展事件，無復發事件，截尾值過多，28例妊娠滋養細胞腫瘤患者無進展生存期及無疾病生存期與外周血β－HCG mRNA表達關系無法進行Logrank檢驗，亦無法采用Cox比例風險回歸模型做多因素預后分析。

3 討論

妊娠滋養細胞腫瘤根據組織學分類包括侵蝕性葡萄胎、妊娠性絨毛膜癌、胎盤部位滋養細胞腫瘤和上皮樣滋養細胞腫瘤。前兩者主要由細胞滋養細胞和合體滋養細胞構成，在我國最常見，江西省也屬高發地區;后兩者主要由中間型滋養細胞構成，較少見。侵蝕性葡萄胎和妊娠性絨毛膜癌在臨床表現、診斷和處理原則等方面基本相同，均具有增生活躍、易早期血行轉移的特點，2000年國際婦產科聯盟(FIGO)婦科腫瘤委員會建議將兩者合稱為妊娠滋養細胞腫瘤。本研究收集的病例為侵蝕性葡萄胎和妊娠性絨毛膜癌，將兩者放在一起討論，不包括中間型滋養細胞腫瘤。

檢測外周血β－HCG mRNA的表達首先需要收集患者新鮮的血液標本，在檢測外周血循環腫瘤細胞的相關文獻中有些作者采用肝素抗凝［2］，也有些作者采用EDTA抗凝［3］。因有文獻提及肝素是一種逆轉錄的抑制劑，對RNA逆轉錄成cDNA的過程有較強的抑制作用［4］。本研究采用EDTA抗凝管收集血液標本，并在4 h內處理血液標本。對于所采集的血液標本量各文獻報道不一。Cohen等收集了50例轉移性結直腸癌患者外周血經免疫磁珠分離技術富集循環腫瘤細胞后，采用流式細胞儀平均每7．5 ml外周血中檢測到2個目標細胞［5］。有文獻稱RT－PCR檢測方法可在106～107個正常細胞中檢出1個目標細胞，相當于在0．1～1 ml血液中檢出1個細胞［6］。本研究在預實驗階段比較了2 ml和4 ml外周血經密度梯度離心后提取總RNA濃度，后者更適合逆轉錄試劑盒說明書中加1 μg總RNA的要求，因此本研究均采集4 ml外周血用于后續實驗。

富集單個核細胞和滋養細胞后最關鍵的是鑒定滋養細胞，依據合體滋養細胞相對特異性表達β－HCG mRNA，分泌β－HCG蛋白，本研究采用常規RT－PCR方法檢測β－HCG mRNA表達以鑒定外周血中的滋養細胞。目前檢測外周血循環腫瘤細胞標志物mRNA表達時除常規RT－PCR［2］方法外，還有學者用到巢式RTPCR或實時熒光定量RT－PCR［3］等，后者是目前較熱門的鑒定外周血循環腫瘤細胞mRNA表達的方法。但多數文獻［3］采用的實時熒光定量RT－PCR仍是相對定量方法，得到目的基因與內參基因的Ct值(循環閾值)后再以2－△△Ct計算樣品中目的基因mRNA相對表達量。實時熒光定量RT－PCR相對定量方法更多用于確定不同處理(如細胞干預實驗中不同時相)的樣本目的基因mRNA的表達差異，適于科研。這種方法用于比較手術前后或不同放化療時程腫瘤患者外周血循環腫瘤細胞mRNA表達變化時更佳，但在比較某腫瘤不同患者外周血循環腫瘤細胞mRNA表達情況時采用實時熒光定量RT－PCR絕對定量方法更佳，這需要制備已知目的基因cDNA拷貝數的質粒或化學合成目的基因cDNA，再繪制標準曲線從而計算樣本中目的基因mRNA表達量，步驟較為復雜，適于臨床應用。呂時銘等［7］將不同細胞濃度的絨癌細胞株(JAR細胞)摻入正常人外周血，經實時熒光定量RT－PCR獲得β－HCG mRNA熒光釋放曲線并以此為外標準，通過檢測妊娠滋養細胞腫瘤患者外周血中β－HCG mRNA熒光釋放曲線推算患者外周血中相應腫瘤細胞的量。但由于腫瘤異質性，不同絨癌細胞株、絨癌細胞株與原代絨癌細胞及正常滋養細胞之間β－HCG mRNA表達均存在差異，以單一絨癌細胞株推算妊娠滋養細胞腫瘤患者外周血滋養細胞數量較為粗略，只能用于估算。鑒于國內外檢測妊娠滋養細胞腫瘤外周血循環腫瘤細胞的相關文獻較少，且標本量均較少［2，7］，本研究先期采用常規RT－PCR初步檢測妊娠滋養細胞腫瘤外周血循環腫瘤細胞β－HCG mRNA表達情況，積累外周血循環腫瘤細胞富集和檢測的經驗和數據，以便后續采用實時熒光定量RT－PCR絕對定量法檢測妊娠滋養細胞腫瘤外周血循環腫瘤細胞β－HCG mRNA表達，深入分析其與妊娠滋養細胞腫瘤早期轉移、化療療程及療效、耐藥及復發等臨床參數的關系，探究其對妊娠滋養細胞腫瘤診斷、治療和預后的指導意義。

檢測非妊娠婦女外周血β－HCG mRNA的表達，可以判斷外周血中血細胞成分(主要是單個核細胞)是否表達β－HCG mRNA，以除外其對外周血中滋養細胞表達β－HCG mRNA的影響。本研究收集了10例非妊娠婦女(單純子宮肌瘤患者)外周血，經外周血密度梯度離心和RT－PCR后均未檢測到β－HCG mRNA特異性擴增條帶，初步說明外周血中單個核細胞不表達β－HCG mRNA。Hotakainen等［8］曾收集了5例非妊娠婦女和6例男性外周血，其中B細胞、T細胞、粒細胞和單核細胞均表達β－lh mRNA，但均不表達β－HCG mRNA。

妊娠時胎盤絨毛持續浸浴在母血中，絨毛膜上的滋養細胞可通過脫落方式直接進入母血。據此國內外已開展從母血中分離胎兒滋養細胞用于無創性產前診斷的研究。Lim等［9］研究發現胎兒滋養細胞和有核紅細胞數量及平均純化百分比隨孕齡增加而下降，孕1～3月母血中胎兒細胞更多，產前診斷宜安排在此期間采血。故本研究選擇采集孕2～3月正常妊娠婦女外周血。Taniguchi等［10］在23例正常妊娠婦女(4～32周)中檢測到1例孕早期婦女表達α－HCG mRNA和β－HCG mRNA。本研究收集的10例正常孕早期婦女外周血中3例見β－HCG mRNA特異性擴增條帶，但條帶亮度較葡萄胎和妊娠滋養細胞腫瘤患者的弱，即正常妊娠婦女外周血β－HCG mRNA表達弱于葡萄胎和妊娠滋養細胞腫瘤患者，可能與葡萄胎和妊娠滋養細胞腫瘤入血的滋養細胞過表達β－HCG mRNA有關，也可能與正常妊娠婦女進入外周血的滋養細胞較葡萄胎和妊娠滋養細胞腫瘤患者少有關。要證實后者需要在滋養細胞鑒定階段采用保留細胞結構的方法如流式細胞儀檢測。

Taniguchi等［10］經外周血密度梯度離心及巢式RT－PCR在7例葡萄胎患者中檢測到3例表達α－HCG mRNA和β－HCG mRNA。本研究在15例葡萄胎患者中檢測到8例表達β－HCG mRNA，且表達強于正常妊娠婦女，與妊娠滋養細胞腫瘤患者無明顯差異，提示相比正常妊娠婦女，葡萄胎患者入血的滋養細胞過表達β－HCG mRNA或有更多的滋養細胞脫落入血。Taniguchi等［10］在4例絨癌患者外周血中檢測到1例表達α－HCG mRNA和β－HCG mRNA。Suzuka等［2］在4例無轉移的侵蝕性葡萄胎患者子宮切除術前及術中外周血中均檢測到β－HCG mRNA表達，術中β－HCG mRNA表達量最高，術后快速下降，并認為即使無轉移外周血也存在滋養細胞播散，手術干預能減少循環妊娠滋養細胞數量。呂時銘等［7］在9例妊娠滋養細胞腫瘤患者治療前外周血中檢測到4例表達β－HCG mRNA，推算腫瘤細胞量為104～107個/10 ml外周血。本研究在28例妊娠滋養細胞腫瘤患者中檢測到24例表達β－HCG mRNA，且表達強于正常妊娠婦女，與葡萄胎患者無明顯差異，提示相比正常妊娠婦女，妊娠滋養細胞腫瘤患者入血的滋養細胞過表達β－HCG mRNA或有更多的滋養細胞脫落入血。

本研究顯示妊娠滋養細胞腫瘤患者外周血β－HCG mRNA表達與年齡、前次妊娠、距前次妊娠時間、最大腫瘤大小、預后評分、耐藥、化療療程及化療療效無關，與治療前血β－HCG水平、肺轉移及臨床分期有關。治療前血β－HCG＜104mIU/ml組β－HCG mRNA表達陽性率低于治療前血β－HCG≥104mIU/ml組。Taniguchi等［10］在3例葡萄胎、1例絨癌及1例正常孕早期婦女外周血中檢測到的β－HCG mRNA表達量與血清β－HCG成正比。這可能與治療前血β－HCG高的患者原發灶中腫瘤性滋養細胞負荷高，相應入血的滋養細胞更多有關。無肺轉移組β－HCG mRNA表達陽性率低于有肺轉移組，同時臨床分期Ⅰ/Ⅱ組β－HCG mRNA表達陽性率低于臨床分期Ⅲ/Ⅳ組，提示外周血β－HCG mRNA表達與妊娠滋養細胞腫瘤轉移有關，可能成為評價妊娠滋養細胞腫瘤早期血行轉移的重要指標。本研究隨訪的28例病例中只有1例進展，無復發病例，目前無法評估外周血β－HCG mRNA與妊娠滋養細胞腫瘤進展及復發的關系。進展的這個病例外周血β－HCG mRNA陽性且相對表達量較高，提示外周血β－HCG mRNA表達可能與腫瘤進展有關，后續可通過增加樣本量并延長隨訪時間來證實。播散在外周血中的腫瘤性滋養細胞可能是妊娠滋養細胞腫瘤復發的重要因素，但由于其復發率相對較低(4%～8%)且復發時間不等(2月～20年)［11］，要評估外周血β－HCG mRNA表達與妊娠滋養細胞腫瘤復發的關系需要多中心研究(增加樣本量)并延長隨訪時間。

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The Relationship between the Expression of β-HCG mRNA in Peripheral Blood and the Hematogenous Metastasis of Gestational Trophoblastic Neoplasia

FAN Sisi，PAN Mei，QIN Haiyan，et al．Nanchang University of Medicine，Nanchang，330006

ObjectiveTo study the expression of β－Human Chorionic Gonadotrophin(β－HCG)in peripheral blood of the patients with gestational trophoblastic tumor，and its relationship with various clinical indicators．MethodsPeripheral blood of 28 cases of gestational trophoblastic tumors，15 cases of hydatidiform moles，10 cases of normal pregnant women and 10 cases of non－pregnant women were collected．Mononuclear cells and trophoblast cells were extracted from the peripheral blood by density gradient centrifugation method，then reverse transcription－polymerase chain reaction(RT－PCR)was used to detect the expression of β－HCG mRNA of the 4 groups．The correlation between the expression of β－hcg mRNA and the clinical indicators of gestational trophoblastic tumor was analyzed．ResultsThe expression of β－HCG mRNA in peripheral blood of 10 cases of non－pregnant women was negative．In 10 cases of normal pregnant women，3 women showed β－HCG mRNA amplified bands．There were 8 cases showed β－HCG mRNA amplified bands in 15 cases of hydatidiform moles．In 28 cases of gestational trophoblastic tumors，β－HCG mRNA amplified bands were seen in 24 patients．The β－HCG mRNA expression of normal pregnancy was lower than that of hydatidiform moles and gestational trophoblastic tumors(P＜0．05)．There were correlation between the expression of β－HCG mRNA and the serumβ－HCG levels before treatment，lung metastasis and clinical stage(P＜0．05)．Only 1 case showed progression among 28 cases during follow－up．No case recurred．ConclusionMononuclear cells in peripheral blood do not express β－HCG mRNA．Trophoblast cells can disseminate into peripheral blood in normal pregnancy，hydatidiform mole and gestational trophoblastic tumor．β－HCG mRNA of trophoblast cell in peripheral blood may be an effective marker in assessing the early hematogenous metastasis of gestational trophoblastic tumor．

Gestational trophoblastic neoplasia;β－Human chorionic gonadotrophin(β－HCG);Density gradient centrifugation;Reverse transcription－polymerase chain reaction(RT－PCR)

10．3969/j．issn．1001－5930．2015．06．005

R737

:A

:1001－5930(2015)06－0806－06

2015－01－06

2015－04－07)

(編輯:甘艷)

330006南昌大學醫學院研究生院(范思斯，鄭芳); 330006江西省婦幼保健院(潘玫，秦海燕)

潘玫