人參皂甙Rgl體外抑制人骨肉瘤腫瘤干細胞增殖的研究

徐子彧 杜心如 駱 輝

人參皂甙Rgl體外抑制人骨肉瘤腫瘤干細胞增殖的研究

徐子彧 杜心如 駱 輝

目的探討人參皂苷Rg1體外抑制人骨肉瘤腫瘤干細胞的作用。方法體外培養MG－63人骨肉瘤細胞，鏡下觀察并行CD133免疫熒光染色;實驗分為生理鹽水組、20 μg/mL人參皂苷Rg1組和40 μg/mL人參皂苷Rg1組;采用四唑鹽比色法(MTT)檢測人參皂苷Rg1對人骨肉瘤腫瘤干細胞增殖抑制作用;DAPI核染檢測人參皂苷Rg1誘導人骨肉瘤腫瘤干細胞凋亡，并分析細胞的光密度和面密度變化。結果培養MG－63人骨肉瘤細胞CD133呈陽性反應; MTT法實驗結果顯示:20 μg/mL和40 μg/mL人參皂苷Rg1對人骨肉瘤腫瘤干細胞的抑制率分別為23．47%和41．84%，明顯低于生理鹽水組(P＜0．05，P＜0．01);DAPI核染檢測結果顯示:與生理鹽水組比較，人參皂苷Rg1組人骨肉瘤腫瘤干細胞的光密度和面密度值均明顯減小，差異有統計學意義(P＜0．01)。結論人參皂苷Rg1對人骨肉瘤腫瘤干細胞的增殖具有抑制作用。

人參皂苷Rg1;骨肉瘤;腫瘤干細胞;增殖

(The Practical Journal of Cancer，2015，30:799～802)

骨肉瘤是骨骼系統常見的骨原發惡性腫瘤，以青少年多見，由于早期診斷難度大，因此，該病的轉移率和病死率較高;近年來，手術技術的進展和新輔助化療的應用提高了骨肉瘤患者的5年之內生存率;然而，受骨肉瘤細胞耐藥和免疫逃逸影響，骨肉瘤的病死率仍居高不下［1］。

近年研究發現，人骨肉瘤細胞中存在小部分與正常干細胞相似的自我更新和分化能力的細胞，即骨肉瘤腫瘤干細胞［2］。依據腫瘤干細胞的生物學特性，目前的治療技術未能將將這部分細胞完全清除;但這小部分細胞的存在，能夠繼續自我更新，不斷增殖和分化形成新的腫瘤細胞和組織，從而轉移和復發［3］。因此，針對性地抑制這些細胞的增殖具有重要的臨床意義。人參皂苷是人參的主要活性成分，人參皂苷Rg1對人骨肉瘤腫瘤細胞的抑制作用已得到研究證實［4－5］，但關于人參皂苷Rg1對人骨肉瘤中腫瘤干細胞的作用少見報告。

1 材料與方法

1．1 材料

MG－63人骨肉瘤細胞由上海遠慕生物科技有限公司提供;人參皂苷(純度95%)購于南京安培化工科技有限公司;DMEM/F12培養基購于Gibco公司;胎牛血清由杭州四季青公司生產;胰蛋白酶，多聚賴氨酸，堿性成纖維細胞生長因子，表皮生長因子，溴化二甲噻唑二苯四氮唑藍(MTT)和二甲基亞砜均為Sigma公司產品;胰蛋白酶，L－－谷氨酰胺，DAPI和山羊血清購于博士德生物工程有限公司;兔抗人CD133單克隆抗體購于上海鈺博生物科技有限公司;山羊抗兔Cy3－IgG熒光二抗為美國Invitorgen生物技術公司提供;酶標儀AD340型為美國Beckman Coulter公司產品;IX70－S8F型倒置相差顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。

1．2 實驗方法

1．2．1 人骨肉瘤細胞培養［6］取人骨肉瘤細胞株，胰蛋白酶消化約5 min，胎牛血清液終止消化，吹打成單細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用無血清DMEM/F12培養液(含L－谷氨酰胺2 mmol/L、胰島素4 U/L、表皮生長因子20 μg/L、堿性成纖維細胞生長因子20 μg/L和青霉素100 U/mL)重懸細胞，將細胞終濃度調整為5×106L－1，在37℃、5%CO2的飽和濕度培養箱中培養，此后每2 d換液1次，連續培養7 d;在細胞對數生長期大約80%時，用0．25 mL/L胰酶消化、離心，用無血清培養基重新吹打成單細胞懸液，按1∶2比例傳代，再接種于培養孔板進行培養，然后進行相應實驗檢測。

1．2．2 CD133免疫熒光染色［7］細胞采用4%多聚甲醛固定30 min，用含有山羊血清和TritonX－100的封閉液孵育1 h，PBS漂洗，然后進行一抗兔抗人CD133單克隆抗體混合液(含有山羊血清和TritonX－100)處理24 h，漂洗后進行二抗山羊抗兔Cy3－IgG熒光處理，漂洗，防淬滅熒光劑進行封片，鏡下攝像。

1．2．3 實驗分組 將培養的CD133陽性細胞球按1 ×106個接種于96孔板，采取隨機法分為3組:生理鹽水組，20 μg/mL人參皂苷Rg1組和40 μg/mL人參皂苷Rg1組。分別給予生理鹽水、人參皂苷Rg1進行干預;1次/d，3組均干預2周，再進行相關實驗檢測。

1．2．4 MTT檢測［8］在細胞終止培養前4 h，將20 μl的MTT溶液加入孔板細胞中，繼續培養4 h，二甲基亞砜振蕩溶解，搖床混勻10 min，采取全自動酶標儀在波長為490 nm下測定細胞的吸光度值(OD值)。細胞抑制率(%)=［(對照組OD值－治療組OD值)/對照組OD值］×100%。

1．2．5 CD133陽性細胞凋亡檢測 采用細胞核(DAPI)染法檢測，具體方法為:吸棄培養板內液體，每孔加入100 μL DAPI(1∶2000)，室溫孵育5 min，漂洗3次，鏡下觀察和拍照。細胞凋亡分析采取CMIAS－II多功能真彩病理圖像分析系統進行分析，每組隨機選10張圖片，每張圖片隨機選10個視野，測量計算所識別的光密度和面密度，分別取兩者平均值進行分析。

1．3 統計學方法

應用SPSS 17．0軟件對所得數據進行分析，以ˉx± s表示計量資料，采用單因素方差分析，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 人骨肉瘤CD133+細胞的培養與鑒定

培養3 d后大部分細胞聚集生長，有成團趨勢，少數細胞發出突起，細胞有較好的折光性，類似干細胞球;免疫熒光檢測顯示:干細胞表面標志CD133在人骨肉瘤類腫瘤干細胞中呈陽性表達。

2．2 人參皂苷Rg1抑制人骨肉瘤腫瘤干細胞增殖

MTT法實驗結果顯示:人參皂苷Rg1干預后細胞的增殖抑制明顯，OD值分別為0．75±0．26和0．57± 0．31;20 μg/mL人參皂苷Rg1對人骨肉瘤腫瘤干細胞的抑制率為23．47%，顯著低于生理鹽水組(P＜0．05);40 μg/mL人參皂苷Rg1組的抑制率為41．84%，極明顯低于生理鹽水組(P＜0．01)，見表1。

表1 人參皂苷Rg1對人骨肉瘤細胞增殖抑制作用(ˉx±s，n=10)

2．3 人參皂苷Rg1誘導人骨肉瘤腫瘤干細胞凋亡

DAPI核染檢測結果顯示:與生理鹽水組比較，人參皂苷Rg1干預后人骨肉瘤腫瘤干細胞的DAPI染色顯著減弱，見圖1。圖像分析發現，與生理鹽水組比較，人參皂苷Rg1組人骨肉瘤腫瘤干細胞的光密度和面密度值均明顯減小，差異有統計學意義(P＜0．01)，見表2。

圖1 人骨肉瘤腫瘤干細胞DAPI染色A為20 μg/mL人參皂苷Rg1組;B為40 μg/mL人參皂苷Rg1組;C為生理鹽水組。

表2 人參皂苷Rg1誘導人骨肉瘤腫瘤干細胞凋亡(ˉx±s，n=10)

3 討論

腫瘤干細胞首次分離是來自于人類白血病，此后從乳腺癌、肺癌、腦腫瘤和前列腺癌等腫瘤中也陸續分離出腫瘤干細胞［9］。從人骨肉瘤中分離腫瘤干細胞是在2005年Parker Gibbs等利用去血清懸浮培養法分離得到［10］。這些細胞具有較強的自我更新能力，并能夠不斷增殖、分化，形成新的腫瘤細胞［10］。實驗檢測顯示，骨肉瘤細胞主要表達間充質干細胞特有的表面標志物。目前發現的骨肉瘤腫瘤干細胞的表面標志物有CD133、CD24、Stro－1和CD90等［11］。在本研究中，參照以往培養方案獲得人骨肉瘤腫瘤干細胞，鏡下大部分細胞聚集生長，有成團趨勢，少數細胞發出突起，細胞有較好的折光性，類似干細胞球;免疫熒光檢測發現干細胞表面標志CD133在人骨肉瘤類腫瘤干細胞中呈陽性表達;因此，在本研究中得到較好特性的人骨肉瘤腫瘤干細胞。

人參皂苷是人參的主要成分之一，對心血管系統、神經系統和免疫系統均發揮了重要調節作用;人參皂苷可通過阻止細胞增殖周期的G0/G1期或誘導細胞死亡的作用機制抑制腫瘤細胞的增殖［5］。近年研究發現，人參皂苷Rg1具有較強的離體和整體抗腫瘤作用［12］，且對人成骨肉瘤MG－63細胞的增殖具有抑制和誘導分化作用［4］。然而，人參皂苷Rg1對人骨肉瘤腫瘤干細胞的增殖是否具有抑制作用尚待闡明。

本研究采取常規人骨肉瘤細胞培養方法，結合前期實驗結果，采用低、高溶度人參皂苷Rg1分別干預培養的CD133陽性細胞，進行MTT檢測和DAPI核染色，分別對人參皂苷Rg1干預效果進行分析。MTT法實驗結果顯示:人參皂苷Rg1干預后人骨肉瘤CD133陽性細胞的增殖明顯被抑制，與生理鹽水組比較，差異有統計學意義(P＜0．01)。DAPI核染檢測結果顯示:人參皂苷Rg1能明顯誘導人骨肉瘤CD133陽性細胞凋亡，與生理鹽水組比較，人參皂苷Rg1組人骨肉瘤CD133陽性細胞的光密度和面密度值均明顯減少(P＜0．01)。以上結果均提示，人參皂苷Rg1對體外培養人骨肉瘤腫瘤干細胞的增殖具有顯著的抑制作用，結合以往人參皂苷Rg2抗腫瘤或骨肉瘤的作用，其作用機制可能與本研究結果有關。

總之，腫瘤干細胞的發現為人骨肉瘤的臨床治療指明了新的方向，人參皂苷Rg1抑制人骨肉瘤腫瘤干細胞增殖作用為臨床治療帶來了新的希望。然而，對腫瘤干細胞的認識目前仍處于初步階段，包括細胞分離培養、增殖信號通路和細胞微環境作用等也尚不明確［12］。本研究僅僅從體外細胞培養角度，結合中藥人參皂苷Rg1的作用進行了探討。下一步本課題準備建立人肉瘤腫瘤干細胞動物模型，從在體水平探討人參皂苷Rg1對腫瘤及其干細胞的作用。

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Inhibitory Effect of Ginsenoside Rg1 on Proliferation of Human Osteosarcoma Cancer Stem Cells in Vitro

XU Ziyu，DU Xinru，LUO Hui．Beijing Chaoyang Hospital，Beijing，100020

ObjectiveTo investigate the inhibitory role of ginsenoside Rg1 on proliferation of human osteosarcoma cancer stem cells in vitro．MethodsMG－63 human osteosarcoma cell were cultured in vitro，then observed under the microscope and received CD133 immunofluorescence staining．The study was divided into normal saline water group，20 μg/mL ginsenoside Rg1 group and 40 μg/mL ginsenoside Rg1 group．Inhibitory effect of ginsenoside Rg1 on proliferation of cancer stem cells of human osteosarcoma cells in vitro was detected by MTT colorimetric method．Induction of apoptosis of ginsenoside Rg1 on proliferation of cancer stem cells of human osteosarcoma cells in vitro was measured by DAPI staining method，optical density and area density were analysed．ResultsMG－63 human osteosarcoma cell cultured in vitro were CD133+positive．MTT assay showed that inhibitory rates of 20 μg/mL and 40 μg/mL ginsenoside Rg1 were 23．47%and 41．84%，respectively，which were obviously lower than that of normal saline group(P＜0．05，P＜0．01)．DAPI staining method showed that compared with normal saline water group，optical density and area density of cancer stem cells of human osteosarcoma cells in vitro remarkably decreased，there had statistical difference(P＜0．01)．ConclusionGinsenoside Rg1 can inhibit the proliferation of cancer stem cells of human osteosarcoma cells in vitro．

Ginsenoside Rg1;Osteosarcoma;Cancer stem cells;Proliferation

10．3969/j．issn．1001－5930．2015．06．003

R738．1

:A

:1001－5930(2015)06－0799－04

2015－04－20

2015－04－28)

(編輯:吳小紅)

100020北京朝陽醫院骨科