魚類爛鰓病病原柱狀黃桿菌溶血素基因的初步研究

李 燁李 楠張曉林秦 婷聶 品

(1. 中國科學院水生生物研究所, 淡水生態與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

魚類爛鰓病病原柱狀黃桿菌溶血素基因的初步研究

李 燁1,2李 楠1張曉林1秦 婷1聶 品1

(1. 中國科學院水生生物研究所, 淡水生態與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

柱狀黃桿菌(Flavobacterium columnare)隸屬于擬桿菌門、黃桿菌綱、黃桿菌目、黃桿菌科, 是重要的水生動物致病菌且呈世界性分布, 魚類感染柱狀黃桿菌以后會引發柱形病(Columnaris disease), 在我國又稱爛鰓病[1]。鮭科(Salmonidae)、鯉科(Cyprinidae)、鯰科(Siluridae)等多科魚類(幾乎所有的淡水魚類)都會感染柱形病[2]。患病魚體會出現爛鰓、體表潰瘍、組織壞死及鰭條腐爛等癥狀,死亡率可高達 100%, 全球每年因柱形病感染引起魚類發病死亡所造成的經濟損失極其嚴重[3]。

柱狀黃桿菌的致病性與環境因素[4]、寄生蟲感染或體表受損傷以及菌株自身毒力[5]等密切相關。研究報道, 柱狀黃桿菌的毒力因子包括黏附因子[6]、硫酸軟骨素酶[7]等。該菌能在添加5% (v/v)無菌羊血的瓊脂平板上產生β溶血[8], 其產生的溶血素(Haemolysin)也是一類重要的毒力因子[9]。溶血素作為細菌致病的重要毒力因子, 在疾病的發病過程中起著不容忽視的作用[10], 但有關柱狀黃桿菌溶血素及其作用機理的相關報道較少。本研究從已構建的柱狀黃桿菌基因組注釋中篩選到一個溶血素基因, 對其進行了克隆和表達, 為進一步研究溶血素的功能及柱狀黃桿菌的致病機理奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種和質粒

柱狀黃桿菌G4菌株由中國科學院水生生物研究所于1972年從患爛鰓病的草魚體內分離并保存, 大腸桿菌(Escherichia coli) M15、Top10均由本實驗室保存。質粒pQE30購于Novagen公司。

1.2 基因組DNA的提取

將實驗室保存的柱狀黃桿菌G4菌株接種于含有托普霉素100 μg/mL的Shieh培養基(5 g/L蛋白胨, 0.5 g/L 酵母粉, 0.0165 g/L CH3COONa·3H2O, 0.01 g/L BaCl2·2H2O, 0.1 g/L K2HPO4, 0.05 g/L KH2PO4, 0.3 g/L MgSO4·7H2O, 0.0067 g/L CaCl2·2H2O, 0.001 g/L FeSO4·7H2O, 0.05 g/L NaHCO3, pH 7.2)[11], 28℃ 150 r/min振蕩培養至細菌對數生長期, 采用基因組提取試劑盒(Omega)提取細菌基因組DNA。

1.3 全菌蛋白和胞外蛋白樣品的制備

取20 mL處于對數生長期的G4菌株的培養液, 6000 r/min離心10min收集菌體, 并用500 μL PBS重懸, 于-80℃保存備用。上清經0.22 μm濾膜過濾后, 用30 kD分子截留濃縮管(Millipore)濃縮, 4000×g離心濃縮至200 μL,于-80℃保存備用。

1.4 溶血素基因序列分析

根據本實驗室構建的柱狀黃桿菌基因組注釋, 篩選到一個溶血素基因hly2031(GenBank: KJ856900.1)。采用BLAST軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進行同源基因的搜索和蛋白序列保守結構域的分析, 通過Translate軟件(http://web.expasy.org/translate/)進行開放閱讀框的搜索、氨基酸序列的推斷及蛋白分子量的預測。

1.5 溶血素基因的克隆及原核表達載體的構建

根據 hly2031序列信息設計特異性引物。正向引物hly2031F-BamHⅠ: 5′-CGCGGATCC ATGGGTTTAGTCAC TGCCAA-3′和反向引物hly2031R-PstⅠ: 5′-AAAACTGCA GTTTAGATTGTAGTTCATCAT-3′, 分別含有 BamH Ⅰ(GGATCC)和 PstⅠ(CTGCAG)酶切位點。以 G4基因組DNA為模板, PCR擴增溶血素基因hly2031。PCR反應程序: 95℃ 5min預變性; 95℃ 30s, 52℃ 30s, 72℃ 1min 40s, 35個循環; 72℃延伸10min, 16℃ 10min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物, 回收并純化目的片段。

采用限制性內切酶 BamHⅠ和 PstⅠ對目的片段和pQE30質粒分別進行雙酶切, 酶切產物用T4DNA連接酶16℃連接過夜, 連接產物轉化至大腸桿菌 M15感受態細胞, PCR篩選陽性克隆并測序鑒定有無移碼或突變。

1.6 重組質粒的誘導表達及SDS-PAGE檢測

將含有溶血素基因的陽性克隆菌液按1∶100的比例稀釋于含有氨芐青霉素100 μg/mL的LB液體培養基中, 37℃200 r/min振蕩培養至A600約0.5, 取出1 mL作為未誘導的陰性對照。加入IPTG至終濃度0.5 mmol/L, 繼續于16℃低速誘導過夜。取1 mL誘導表達菌液及未誘導對照菌液5000 r/min離心5min回收菌體沉淀。為了檢測目的基因的表達形式, 取出誘導后的表達菌液4 mL, 離心收集菌體,用500 μL PBS緩沖液重懸, 超聲破碎處理, 離心分別收集上清和沉淀, 并將獲得的沉淀重懸于500 μL PBS。將以上獲得的樣品進行SDS-PAGE分析。

1.7 重組蛋白的純化及多克隆抗體的制備

根據以上SDS-PAGE分析結果, 用濃度為0.5 mmol/L IPTG誘導200 mL菌液大量表達重組蛋白。5000 r/min離心5min收集菌體, 用8 mL Binding Buffer重懸沉淀并經超聲波處理, 4℃ 14000 r/min離心30min收集上清并經0.22 μm濾膜過濾。使用His·Bind樹脂純化蛋白, 詳細步驟參考His·Tag融合蛋白純化操作手冊。

用以上純化的重組蛋白對家兔進行如下免疫: 初次免疫用400 μL(約1 μg/μL) 腘蛋白樣品多點注射兔 淋巴結及腳掌。2周以后加強免疫, 用300 μL(約1 μg/μL)蛋白樣品多點注射于背部皮下及腳掌。4周以后再次加強免疫并于6周后動脈取血, 將分離的血清分裝并保存于-80℃。

1.8 溶血活性檢測

取10 μL誘導表達菌液滴加到含5% (v/v)無菌脫纖維綿羊血的固體LB平板, 37℃培養箱靜置培養; 取500 μL誘導表達菌經超聲破碎后的上清液滴加到5%(v/v)Shieh血平板, 28℃培養箱靜置培養; 將5 μL純化后的重組蛋白(約1 μg/μL)滴加到5% (v/v) Shieh血平板, 28℃培養箱靜置培養。

1.9 Western blot檢測

將-80℃凍存的細菌菌體、上清樣品及純化蛋白經10% SDS-PAGE凝膠電泳分離, 電轉移至硝酸纖維素膜上。5%的脫脂牛奶(溶于PBS緩沖液中)室溫封閉1h, 加入2%脫脂奶粉(溶于PBST中)稀釋的兔抗溶血素多克隆抗體室溫孵育2h, 再加入2%脫脂奶粉(溶于PBST中)稀釋的堿性磷酸酶偶聯的羊抗兔IgG抗體, 室溫下孵育1h。以上各步驟間用PBST洗膜3次, 每次5min, 最后DAB顯色。

2 結果

2.1 溶血素基因的克隆及序列分析

hly2031基因開放閱讀框全長1812 bp, 編碼603個氨基酸, 分子量69.4 kD, 理論等電點8.36。軟件預測顯示,在蛋白分子內沒有糖基化位點, 沒有信號肽, 無跨膜結構區。BLAST比對結果表明, 該基因與柱狀黃桿菌ATCC49512溶血素(YP_004943259.1)有 99%的一致性和100%的相似性, 與嗜冷黃桿菌(Flavobacterum psychrophilum)假設的溶血素(YP_001295003.1)有 85%的一致性和92%的相似性。在實驗室中同時構建了柱狀黃桿菌G18菌株的基因組注釋, 從中篩選到溶血素(G18GL000072),與G4菌株溶血素有100%的一致性和100%的相似性。

2.2 溶血素在大腸桿菌中的表達及溶血活性檢測

將構建好的重組表達載體轉入宿主表達菌 M15, 在IPTG濃度為0.5 mmol/L下16℃低速過夜誘導。表達產物經10% SDS-PAGE分析, 與未誘導菌相比, IPTG誘導菌在70 kD附近均有一條明顯的蛋白條帶, 與預期結果相符,說明誘導表達成功。將IPTG濃度為0.5 mmol/L的誘導菌超聲破碎后收集上清和沉淀, 均可見大小約為70 kD的蛋白條帶。以純化的蛋白質作為免疫原制備了兔抗柱狀黃桿菌溶血素的多克隆抗體。純化蛋白經Western blot分析顯示, 可檢測到大小約為 70 kD的蛋白條帶(圖 1)。在 5% (v/v)無菌羊血平板上, 誘導表達菌、誘導表達菌經超聲破碎后的上清液及重組蛋白的周圍均沒有觀察到明顯的溶血環。

2.3 溶血素在柱狀黃桿菌中的表達

Western blot檢測結果顯示, 在柱狀黃桿菌全菌蛋白和胞外蛋白中均能檢測到大小約 70 kD目的條帶(圖 2),并且胞外蛋白表達量約占全菌蛋白表達量的64%。

3 討論

在許多致病菌當中, 溶血素都作為重要的毒力因子參與細菌的致病過程。例如, 霍亂弧菌(Vibrio cholerae)溶血素能裂解紅細胞和其他多種哺乳動物細胞, 腹瀉實驗顯示溶血素具有腸毒性, 在霍亂弧菌引起的胃腸炎發病過程中發揮著重要作用[12]。

圖 1 重組蛋白的表達、純化和Western blot檢測Fig. 1 Expression and purification and western blot analysis of recombinant protein

圖2 目的蛋白在G4菌株中的表達Fig. 2 Expression of the haemolysin protein in Flavobacterium columnare G4strain

根據基因的結構與功能特點將溶血素分為重復子毒素家族(Repeats in toxin family, RTX)[13]、硫醇活性膽固醇結合細胞溶素家族(Family of thiol-activated, cholesterolbinding toxins, CBTs)[14]、沙雷氏菌屬(Serratia)溶血素家族[15]等。在基因的相互作用上, RTX家族溶血素依賴于一個由四個功能相關的基因構成的操縱子發揮作用[16]。黏質沙雷氏菌(Serratia marcesces)溶血素溶血活性的發揮依賴于兩種蛋白的共同作用, 是由兩個毗鄰的相關基因共同控制的結果[15]。本研究篩選了柱狀黃桿菌G4菌株的一個溶血素基因并對其進行序列分析, G4溶血素與柱狀黃桿菌ATCC49512溶血素、嗜冷黃桿菌溶血素序列相似性都很高, 但在該溶血素序列中未發現上述溶血素家族的保守結構域, 在其上下游區域也未搜索到與溶血功能相關的基因存在, 分析該基因可能獨立發揮作用或者和其他相關基因共同作用。

研究發現, 不同溶血素基因的體外表達模式具有一定的差異, 如鰻弧菌(Vibrio anguillarum)中有多個溶血素基因, 其中 vah5編碼 585個氨基酸并表達一種大小為66 kD的溶血素蛋白, 且在大腸桿菌中能表達出具有溶血活性的VAH5蛋白, 表明其能單獨發揮溶血功能[17]。嗜冷黃桿菌溶血素和 VAH5具有一定的相似性[18], 都具有兩個與酰基轉移酶相關的功能域。然而, 由于密碼子使用偏好性不同等原因, 嗜冷黃桿菌溶血素基因及其他多種基因在大腸桿菌中無法以可溶形式表達或產生分子量偏小的蛋白產物, 但在副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)中能表達分子量正確的嗜冷黃桿菌溶血素蛋白且具有可溶性, 推斷副溶血弧菌可能是一種替代表達載體[19]。為了進一步研究溶血素基因的體外表達模式, 本研究對柱狀黃桿菌溶血素基因進行原核表達, 重組蛋白能以可溶形式表達在上清中。這為在大腸桿菌中表達柱狀黃桿菌基因提供了一定的參考, 同時為后續深入研究重組蛋白活性奠定了基礎。

溶血素是許多細菌的胞外產物, 如大腸桿菌 α-溶血素(HlyA)是通過I型分泌系統分泌的RTX蛋白, 能對紅細胞、內皮細胞、單核細胞等多種類型的哺乳動物細胞產生毒素作用[10]。本研究在柱狀黃桿菌全菌蛋白和胞外蛋白中經Western blot均能檢測到大小約為70 kD的目的條帶,證明該溶血素是一種分泌型蛋白, 與多數溶血素分泌后發揮作用的模式相同。但是, 在綿羊血血平板上并未檢測到該重組蛋白的溶血活性。在嗜冷黃桿菌中發現, 細菌胞外蛋白與紅細胞共同孵育后也沒有溶血現象, 該溶血素可能無法獨立發揮作用或者合成后位于細菌表面而不是分泌至胞外, 其溶血功能的發揮可能具有接觸依賴性,可能依靠細菌細胞壁上的凝集素與紅細胞膜上的唾液酸相結合促發后續溶血素蛋白的溶細胞過程[20]。研究報道,細菌凝集素在細胞裂解酶(例如溶血素)的溶細胞過程中起到協同作用, 凝集素與裂解酶形成一個大分子或者單獨兩個分子結合于細菌表面或者游離于細菌外[21]。因此,可以推論柱狀黃桿菌的溶血素蛋白分泌至胞外后可能無法單獨發揮溶血功能, 可能也需要細菌及其凝集素的參與, 這有待于進一步的研究證實。

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PRELIMINARY STUDY ON HAEMOLYSIN GENE IN FLAVOBACTERIUM COLUMNARE, THE PATHOGEN OF COLUMNARIS DISEASE OF FISH

LI Ye1,2, LI Nan1, ZHANG Xiao-Lin1, QIN Ting1and NIE Pin1
(1. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

柱狀黃桿菌; 溶血素; 基因; 表達

Flavobacterium columnare; Haemolysin; Gene; Expression

S917.4

A

1000-3207(2015)03-0604-04

10.7541/2015.79

2014-05-09;

2014-11-29

國家重點基礎研究發展計劃項目(2009CB118703)資助

李燁(1989—), 女, 河北廊坊人; 碩士研究生; 主要從事魚類病原微生物研究。E-mail: liye891212@163.com

聶品, E-mail: pinnie@ihb.ac.cn