微囊藻群體內生黏偽魚腥藻熒光特征及空間分布

莊惠如黃祖芳翁笑艷盧 瑋舒惠琳

(1. 福建師范大學生命科學學院, 福州 350007; 2. 福建師范大學醫學光電科學與技術教育部重點實驗室, 福州 350007; 3. 福州市環境監測站, 福州 350011 )

微囊藻群體內生黏偽魚腥藻熒光特征及空間分布

莊惠如1黃祖芳2翁笑艷3盧 瑋1舒惠琳1

(1. 福建師范大學生命科學學院, 福州 350007; 2. 福建師范大學醫學光電科學與技術教育部重點實驗室, 福州 350007; 3. 福州市環境監測站, 福州 350011 )

水華是淡水水體富營養化進程中形成的一種現象,藍藻水華產生的巨大生物量、藻毒素以及異味物質已對公共衛生、人體安全和水體生態系統構成了極大的威脅, 由此引起的水環境問題已成為國內外普遍關注的焦點。微囊藻屬(Microcystis Kutz.)是主要的水華藍藻生物, 在自然水體中, 該植體成微觀或目力可見的膠群體。偽魚腥藻屬(Pseudanabaena Lauterborn)則是絲狀體型的藍藻。有研究表明, 偽魚腥藻不僅是常見的水華藍藻, 部分種類也是藍藻毒素和異味化合物的生產者[1,2]。我們在調研福建省典型飲用水源地藍藻水華發生狀況的過程中發現, 一種極微小的黏偽魚腥藻P. mucicola 常在水華爆發期間大量增殖, 并且常以內生的習性生活在微囊藻群體的膠被中。由于普通顯微鏡在分辨率和清晰度上的局限性, 多年來,在浮游植物種類鑒定和水體污染生物監測過程, 體型微小的P. mucicola 往往被忽略了。迄今為止, 有關黏偽魚腥藻和微囊藻伴生的生理生態學研究也尚未見報道。

激光共聚焦掃描顯微鏡(LCSM)是一種集激光、顯微鏡和計算機于一體的新型、高精顯微鏡系統。與其他顯微鏡相比, LCSM 不僅具有成像分辨率高、樣品制片簡單等優點, 在活細胞的動態觀察、顯微熒光圖像處理、熒光定位定量分析、組織細胞的光學連續切片和三維結構重建等方面均具有明顯的優勢[3]。我們曾應用LCSM對幾種海洋微藻結構的熒光圖像、光譜特性等方面進行研究嘗試, 并獲得初步成效[4,5]。本文應用LCSM研究偽魚腥藻在微囊藻群體中的空間分布及其熒光特性, 旨在進一步拓展LCSM 在微藻研究領域的應用范圍, 為水華藍藻的生理生態研究提供一種有效新方法。

1 材料與方法

1.1 水樣采集與樣品制備

水樣于夏季取自福州山仔水庫藍藻水華聚集的表層水, 經光學顯微鏡觀察, 并在形態學鑒定的基礎上, 取活體微囊藻群體和游離生活的黏偽魚腥藻個體, 直接滴在載玻片上制成臨時水裝片進行LCSM觀察。

1.2 激光共焦掃描顯微鏡系統

采用 LSM510 型激光共聚焦掃描顯微鏡(德國Zeiss), 單光子激發光源, 波長為 488 nm Ar+激光器(美國相干公司), 最大輸出功率 30 mW。物鏡40×(NA=0.75)用于激發和采集光信號。實驗設置合適的濾色片獲得藻體的熒光圖像。同時, 在Lambda 模式下, 通過軟件附帶的圈選工具, 測量隨機選定的 10—20個藻細胞的熒光強度值, 統計不同細胞的平均熒光強度, 獲得樣品平均熒光強度與發射波長(500—714 nm)之間的二維熒光光譜。另外對微囊藻群體進行不同深度的逐層掃描, 每個群體掃描約35層, 每層厚度為1 μm, 將同一群體的系列掃描圖像進一步三維處理后獲得三維熒光圖像。

2 結果

2.1 微囊藻群體內生偽魚腥藻的形態學特征

微囊藻植體成熟時由許多小群體聯合組成不規則網狀或窗格狀的團塊, 群體膠被透明, 易水化或堅實[6]。鏡檢觀察發現, 不同種類的微囊藻膠被中, 常見一種個體極微小的短絲體藍藻附生或內生(圖版Ⅰ-1—3)。此外, 水體中還有一定數量的游離生活個體, 表明該藍藻的生活習性可能以內生為主, 兼性浮游。該藍藻絲體多由 3—6個細胞構成, 直或稍有彎曲, 不具膠鞘, 細胞橫壁處有收縊或不明顯, 細胞長大于寬, 圓柱形, 寬約 0.5—0.8 μm,原生質體均勻, 不具氣囊。根據Anagnostidis & Komárek的藍藻分類系統[7]上述微囊藻群體內生的藍藻初步鑒定為黏偽魚腥藻 Pseudanabaena mucicola (Naumann & Huber-Pestalozzi) Schwabe。

鏡檢結果發現, 不同種類的微囊藻群體中, 偽魚腥藻內生程度不一。其中, 膠被明顯但易水化的銅綠微囊藻(M. aeruginosa)和細胞排列疏松的史密斯微囊藻(M. smithii)群體中內生的偽魚腥藻數量較多。膠被寬厚堅實的惠氏微囊藻(M. wesenbergii)群體中內生的偽魚腥藻較少。而膠被不明顯的魚害微囊藻(M. ichthyoblabe)以及細胞排列比較密實的水華微囊藻(M. flosaquae)群體中則少見偽魚腥藻附生。

2.2 微囊藻群體內生黏偽魚腥藻及游離個體的自發熒光圖像及其光譜

為了證實微囊藻群體內生短絲體及其游離個體的藍藻屬性, 應用共聚焦掃描顯微鏡分別收集水樣中不同個體的熒光信號。圖Ⅰ-4—5是在 LSCM 中, 用 488 nm Ar+激光激發獲得的微囊藻群體內生黏偽魚腥藻和游離個體的自發熒光圖像。微囊藻和黏偽魚腥藻均是原核生物,細胞原生質體均勻, 沒有葉綠體等細胞器結構。所以, 由激光激發藻細胞內分散的色素物質發出的紅色熒光使藻體形態清晰可見。

圖1a是在Lamda模式下, 隨機選取20個游離個體收集熒光信號獲得的平均熒光光譜圖。由圖 1a可知, 游離生活黏偽魚腥藻的自發熒光在500—714 nm 范圍內有 2個明顯的主峰, 其中小高峰位于580 nm 處, 此為藍藻藻紅蛋白(C-PE)的特征峰[8]; 最高峰出現在661 nm, 是別藻藍蛋白(APC)的熒光峰; 在 682 nm處還有一個不明顯的肩峰, 其歸屬于藻膽體中末端發射體(APC-B)和葉綠素 a的熒光峰。藻膽蛋白是藍藻、紅藻及隱藻門的捕光色素蛋白, 包括三大類即藻藍蛋白(PC, λem 650 nm)、別藻藍蛋白(APC, λem 660 nm)和藻紅蛋白(PE, λem 577 nm)[9,10]。藍藻細胞主要含藍色的藻藍蛋白和別藻藍蛋白, 故藻體多呈藍綠色。上述結果表明, P. mucicola細胞不僅含有藻藍蛋白, 還含有藻紅蛋白。此結果與文獻中有關偽魚腥藻種類具有藻紅蛋白的報道[11]相吻合。

圖1b是隨機選取群體中微囊藻和內生黏偽魚腥藻的20個細胞收集熒光信號, 分別獲得微囊藻和內生黏偽魚腥藻的熒光光譜圖。由圖1b可知, 群體內生黏偽魚腥藻的自發熒光除了在 575 nm 處有一小高峰外, 在 650 nm (PC特征峰)處出現一高峰后, 譜線繼續走高(661 nm、671 nm)至682 nm達到最高峰。和游離生活個體的光譜相比, 群體內生偽魚腥藻的 PE熒光峰由 580 nm偏移至575 nm, 最高峰移至682 nm處。此外, 在650—682 nm之間, 由于PC、 APC、APC-B和 Chl. a的熒光發射峰彼此接近, 因此形成一個寬大并平緩走高的峰形。顯然,群體內生的細胞與游離生活的個體在熒光光譜上存在一定差異。

圖1 微囊藻群體內生偽魚腥藻及游離個體自發熒光光譜Fig. 1 The autofluorescence spectra of endogenous P. mucicola in mucilage of Microcystis and free P. mucicola

比較圖1b中黏偽魚腥藻和微囊藻的自發熒光光譜還可知, 微囊藻沒有PE峰(575 nm), 但在650—682 nm也同樣呈現一個寬大并平緩走高的熒光峰。此外, 從熒光強度上看, 內生黏偽魚腥藻在 650—682 nm的峰值均高于微囊藻的。此結果顯示, 黏偽魚腥藻和微囊藻在捕光色素構成上也有明顯差異。

2.3 黏偽魚腥藻在微囊藻群體中空間分布的熒光分析

利用 LSCM 對微囊藻群體進行不同深度的逐層掃描,結果顯示, P. mucicola 多數內生在微囊藻群體外部的膠被中, 部分個體可深入群體內部, 但數量較少(圖版Ⅰ-6—11)。

圖2a是在Lamda模式下, 分別選取群體邊緣和中部內生的黏偽魚腥藻各10個個體, 用488 nm Ar+激光激發獲得的平均熒光光譜。由圖 2a可以看出, 不同部位內生的黏偽魚腥藻細胞的熒光光譜峰形是一致的, 但熒光峰值存在一定差異。位于中部的黏偽魚腥藻細胞較邊緣的具有相對較高的熒光峰值。進一步對光譜中主要熒光峰的比較結果表明(圖 2b), 群體中部內生的黏偽魚腥藻比分布群體邊緣的個體具有相對較高的PE/PC值, 而Chl. a/PE值則較低, Chl. a/PE值差異不明顯。此結果表明, 位于群體中部的黏偽魚腥藻其藻紅蛋白可能含量較高。

圖2 群體中不同部位偽魚腥藻自發熒光光譜比較Fig. 2 The compare of autofluorescence spectra of endogenous P. mucicola in different parts of colony

3 討論

偽魚腥藻隸屬于藍藻門, 顫藻目, 偽魚腥藻科。形態上與偽魚腥藻比較相近的藍藻是澤絲藻屬(Limnothrix Meffert)種類。但后者藻絲橫壁處不收縊, 細胞多具氣囊[7]。國外對偽魚腥藻的研究除了傳統的形態分類, 生理生態外, 還涉及分子生物學、異味物質及毒性生理等。近年來,國內在湖庫浮游植物的調查中, 偽魚腥藻種類時有報道,但少有針對偽魚腥藻的研究。潘雙葉等[11]曾對亭下水庫偽魚腥藻的晝夜垂直變化進行研究, 但未確定其種類名稱。在光學顯微鏡下, 黏偽魚腥藻不僅體型微小, 體色也多呈透明 勻質狀態。在生態習性上, 黏偽魚腥藻喜內生在其他浮游藍藻群體膠被中。因此, 以往的浮游生物調查過程, 容易把微囊藻群體中內生的黏偽魚腥藻歸屬到細菌等微生物范疇。本研究利用 LSCM觀測活體材料的便利性, 并根據熒光光譜特征, 可以判斷這種內生的絲狀體為藍藻種類。進一步根據其藻絲短, 橫壁有收縊以及無氣囊等形態學特征, 基本可以確定其分類屬性。雖然黏偽魚腥藻分布廣, 數量大, 但國內的相關報道卻極為有限。造成文獻檢索不到的原因, 除了體型微小, 易被忽略外, 可能還與分類鑒定所使用的分類系統不一致有關。

本研究發現, 在水華發生期間, 不同種類的微囊藻或多或少均有黏偽魚腥藻殖入性內生或附生其群體的膠質中。顯然, 群體膠被的厚薄、質地是影響黏偽魚腥藻內生數量多寡的主要因素。本研究還發現, 黏偽魚腥藻的生活習性是以內生為主, 兼性浮游, 在細胞密度上有時可成為水華的次優勢種。在浮游植物數量周年變化的調查過程, 還發現, 微囊藻和黏偽魚腥藻在數量上存在某種對應關系(結果另文報道), 此也映證了二者的伴生關系。

本文首次應用激光共聚焦掃描顯微術, 針對黏偽魚腥藻的熒光光譜特性進行研究。結果發現, 黏偽魚腥藻細胞不僅含藻藍蛋白也具有藻紅蛋白。Silvia等[8]曾對 28株偽魚腥藻進行表型與基因型的研究, 結果表明, 約占63%的種類, 其細胞中既含有藻藍蛋白也有藻紅蛋白。Kling等[12]對一種紅色偽魚腥藻的研究結果發現, 該藻體顏色在低光強條件呈紅色, 暴露在高光下則變成綠色,并推斷藻紅蛋白的存在與其色適應能力有關。Silvia等[8]的光譜分析也表明, 不同光質條件下偽魚腥藻的吸收光譜中, PE/PC和Chl. a/PC的比率存在差異。本研究結果顯示, 游離生活的黏偽魚腥藻個體與群體內生的細胞在熒光光譜上既有共性又存在一定差異。二者均具有 PE峰,但前者的最高熒光峰來自APC, 后者的PC、APC和Chl. a均有較強的熒光發射。此外, 群體內不同部位藻細胞的熒光光譜峰形一致, 但熒光峰值發生變化, 尤其是PE/PC和Chl. a/PC比率的不同顯示其色素含量的變化。究其原因, 筆者認為, 微囊藻群體膠被的存在是產生差異的重要原因, 由于光線透入群體膠被時產生的強弱變化, 可能導致藻細胞在捕光色素構成、含量以及光能傳遞效率上的變化。本研究結果為偽魚腥藻的色適應能力提供了佐證。

此外, 本研究還利用 LSCM 的連續光切片方法, 對自然狀態下的微囊藻群體進行逐層掃描, 成功獲得黏偽魚腥藻在微囊藻群體中的空間分布信息, 這不僅為黏偽魚腥藻與微囊藻相互關系的進一步研究提供重要依據,也為水華藍藻的形態學和微觀生態研究提供了一種便捷而有效的方法。鑒于黏偽魚腥藻在藍藻水華發生期間的數量之多, 進一步對該種的生理生態以及產毒與否進行深入研究尤顯必要, 也極具現實意義。

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STUDY ON THE FLUORESCENCE SPECTRAL CHARACTERISTICS OF PSEUDANABAENA MUCICOLA AND SPATIAL DISTRIBUTION IN MUCILAGE OF MICROCYSTIS

ZHUANG Hui-Ru1, HUANG Zu-Fang2, WENG Xiao-Yan3, LU Wei1and SHU Hu-Lin1
(1. School of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China; 2. Key Laboratory of Opto-Electronic Science and Technology for Medicine, Ministry of Education, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China; 3. Fuzhou Environmental Monitoring, Fuzhou 350011, China)

黏偽魚腥藻; 微囊藻; 熒光光譜; 激光掃描顯微術; 空間分布

Pseudanabaena mucicola; Microcystis; Fluorescence spectra; LSCM; Spatial distribution

圖版Ⅰ 黏偽魚腥藻在微囊藻群體內的空間分布圖PlateⅠ The image of spatial distribution of P. musicola in Microcystis spp. colony

Q949.2

A

1000-3207(2015)03-0633-05

10.7541/2015.84

2014-06-30;

2014-11-26

福建省科技廳社會發展重點項目(2012Y0023)資助

莊惠如(1957—), 女, 福州人; 教授, 碩士; 主要從事藻類生理生態研究, E-mail: huang@fjnu.edu.cn