反義miR-224對乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響

駱 萍 石冬梅 邱 楊 鐘曉鳴

MicroRNAs(miRNA)是1種大小約為21～25個堿基的非編碼單鏈小分子RNA，是一類新的基因調節子，其在控制細胞的生長、發育、分化、新生血管形成和凋亡等生物學過程中發揮著非常重要的作用［1］。研究已經證實miR-224在多種惡性腫瘤中表達失調［2-8］，然而miR-224在乳腺癌中的表達及功能研究尚未見報道。本實驗采用TagMan MGB探針法檢測miR-224在乳腺癌組織中的表達情況，同時利用反義寡核酸技術(antisense oligonucleotide，ASO)抑制 miR-224在乳腺癌細胞中的表達，分析miR-224對乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2013年10月至2014年06月江西省腫瘤醫院和南昌市第三醫院乳腺外科乳腺癌及對應癌旁組織手術標本120份。所有標本均經病理學檢查確診，均為女性，年齡28～62歲，患者術前均未接受放化療。

1.2 主要試劑和儀器

乳腺癌MCF-7細胞由本實驗室保存;TaqMan miRNA分析試劑盒(美國ABI公司);DMEM高糖培養基(美國Gibco公司)、胎牛血清(美國Hyclone公司)、脂質體Lipfectamine 2000(美國Invitrogen公司);反義miR-224寡核苷酸(miR-224 ASO)(大連寶生物公司);Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(南京凱基公司);總蛋白提取試劑盒(碧云天);鼠抗人Bcl-2單克隆抗體(美國santa cruz公司);實時熒光定量PCR分析儀(美國ABI公司)，流式細胞儀(美國BD公司)。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量PCR檢測miR-224的表達 采用Trizol試劑提取腫瘤組織及對照組織中總RNA，采用紫外分光光度計測定濃度，-80℃保存，運用miR-224檢測試劑盒檢測miR-224的表達。首先取2 μg總RNA為反應模板與3 μl逆轉錄酶相互混合，反應體系為20 μl，反應條件為:16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85℃ 5 min。反應結束后，收集cDNA，將其稀釋150倍，然后取1 μl稀釋的cDNA與 2 μl TaqMan引物相混合，20 μl反應體系:95 ℃ 10 min，隨后95 ℃ 15 s，59℃ 60 s，40個循環。相對miRNA表達采用ct值精確計算，將U6 snRNA作為內參。

1.3.2 反義miR-224單核苷酸序列設計 MiRBase提供的miRNA基因序列獲取人miR-224的序列，并設計其反義寡核苷酸序列，同時運用核酸序列數據庫檢索程序以排除其它的同源序列。另外，同時設計一條隨機對照序列，如下所示:miR-224 sense:5＇AGUCACUAGUGGUUCCGUUUA 3＇，反義 miR-224 antisense:5 ＇TAAACGGAACCACTAGTGACT 3＇，隨機序列 sense:5＇UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3 ＇，antisense:5 ＇ACGUGACACGUUCGGAGAATT 3＇，送 Invitrogen 公司合成，PAGE純化，全硫代修飾。

1.3.3 細胞培養和反義寡核苷酸轉染 將MCF-7乳腺癌細胞接種于DMEM培養基(含10%胎牛血清)，5%CO2、37℃條件下培養。嚴格遵照Lipfectamine TM 2000轉染試劑盒操作程序進行轉染，反義miR-224寡核苷酸終濃度分別為:50 nmol/L、100 nmol/L，150 nmol/L，200 nmol/L，本實驗組前期初步篩選出最佳終干擾濃度為100 nmol/L。轉染后培養時間分別為24 h、48 h、72 h，初步篩出最佳作用時間為48 h。將熒光對照的反義寡核苷酸轉染后放置于倒置熒光顯微鏡下進行觀察，上述操作重復3次。轉染效率(88.5%±6.4)%。

1.3.4 轉染miR-224 ASO后對miR-224表達的影響轉染 miR-224 ASO與對照 ASO 48 h后，提取總RNA，測定濃度，逆轉錄為 cDNA(反應條件同1.2.1)，測定cDNA濃度。運用miR-224檢測試劑盒檢測miR-224的表達(具體條件同1.2.1)。上述操作重復3次。

1.3.5 克隆形成實驗檢測MCF-7細胞的增殖 乳腺癌MCF-7細胞經轉染后，取對數生長期的細胞，用含3%胰蛋白酶消化細胞。接種于6孔培養板中，大約500～600個細胞/孔，置37 ℃、5%CO2，飽和濕度的條件下，培養2～3周。觀察細胞生長情況，當培養皿中出現肉眼可見的克隆細胞團時，終止培養。移去上清液，運用PBS漂洗2次。加甲醇固定20 min，去除固定液，加適量Giemsa應用染色液染30 min，用ddH2O清洗染色液，經干燥后在顯微鏡下計數大于50個細胞的克隆數，克隆形成率=克隆數/接種細胞數×100%。上述操作重復3次。

1.3.6 MTT檢測MCF-7細胞增殖情況 收集MCF-7細胞，將各組細胞懸液在離心管內反復充分打勻，接種于96孔培養板(6×103/孔)，24 h后換液。實驗分組同1.2.4，每組設有6個復孔。轉染后1 d～4 d每孔加入 MTT 試劑(濃度為 5 mg/mL)20 μL，在 5%CO2、37℃條件下繼續孵育4 h。用移液器吸取各孔上清，加入DMSO 150 μL/孔，在室溫條件下搖10 min(置水平搖床)以充分完全溶解MTT結晶。測定各孔吸光值(波長490 nm)。每組重復3次。按下列公式計算細胞生長抑制率(%):細胞生長抑制率 =(實驗組平均A490-對照組平均A490)/對照組平均A490×100%。上述操作重復3次。

1.3.7 活體內檢測miR-224 ASO對MCF-7細胞增殖的影響 將20只(4～5周齡)裸鼠(上海斯萊克公司)飼養于SPF無菌環境下。MCF-7細胞在濃度為300 μg/ml的G418抗生素條件下，篩選出穩定克隆對照ASO或miR-224 ASO的U2-OS細胞株，取對數期生長的細胞(約2～ ×106個)制成150 μl細胞懸液，運用微量注射器接種于裸鼠左側大腿背部皮下。成瘤后定期測量腫瘤的大小，并運用公式(V=D×d2×π/6)(D，d分別代表腫瘤的最大直徑和最小直徑)計算腫瘤的體積［6］，繪制腫瘤生長曲線。飼養6周后處死裸鼠，取瘤稱重。經福爾馬林固定、石蠟包埋、HE染色后，在光鏡下觀察腫瘤組織的病理學特征。

1.3.8 流式細胞術分析細胞早期凋亡 實驗分組同1.3.4，將細胞接種于6孔板中，轉染反義miR-224寡核苷酸。經48 h后收集細胞并制備為單細胞懸液，采用PBS漂洗2次，離心、棄上清。最后運用Annexin V-FITC早期凋亡試劑盒和流式細胞儀檢測各組細胞的早期凋亡情況。上述操作重復3次。

1.3.9 檢測各組細胞Bcl-2 mRNA的表達水平 各組培養細胞加入Trizol裂解液，提取總RNA，逆轉錄為cDNA，應用SYBR Green Real Time PCR Master Mix通過熒光定量PCR方法檢測Bcl-2的mRNA表達。Bcl-2的引物序列為上游:5＇-AACTGGGG GAGGATTGTGGC-3＇;下游:5 ＇-GATCCAGGTGTGCAGGTGCC-3 ＇。反 應條件:95℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸30 s，40個循環。以GAPDH作為內參。在ABI7500反應平臺上進行PCR反應。

1.3.10 檢測各組細胞Bcl-2蛋白的表達水平 收集轉染miR-224 ASO的MCF-7細胞，運用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，經10%SDS-PAGE電泳后轉膜，將膜放在含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中37℃封閉2 h，加一抗稀釋液1∶500稀釋鼠抗人Bcl-2單克隆抗體在4℃孵育過夜，1×TBST緩沖液洗膜10 min×3次，加辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG(1∶1 000稀釋)，置于37℃孵育2 h，1×BST緩沖液洗膜10 min×3次，應用ECL化學發光法檢測目的蛋白條帶，以βactin作為內參。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 乳腺癌組織中miR-224的表達情況

應用實時熒光定量PCR檢測發現120例乳腺癌患者的癌組織及癌旁組織，結果發現:69.17%(83/120)的乳腺癌組織miR-224表達水平明顯高于相對應的正常癌旁組織的，有統計學意義(P=0.00)(圖1)。

圖1 癌組織及癌旁組織中miR-224的表達

2.2 降低miR-224的表達對MCF-7細胞存活率的影響

轉染miR-224 ASO后，通過熒光定量PCR方法檢測發現miR-224的相對表達量(0.09±0.01)較對照組(0.50 ±0.07)明顯降低(P=0.00)(圖 2A)。同時MTT檢查結果發現:轉染miR-224 ASO后組細胞生長較對照組明顯降低，其24 h、48 h和96 h的細胞生長抑制率分別為:53.57%、59.13%和 70.08%，兩者差異均有統計學意義(P＜0.05)(圖2B)。

2.3 降低miR-224的表達對體外MCF-7細胞增殖的影響

觀察克隆形成實驗結果發現:miR-224ASO經轉染后，MCF-7細胞克隆形成率［(5.33±0.74)%］較對照組［(33.33 ±8.38)%］有明顯降低(P=0.00)。

2.4 降低miR-224的表達對MCF-7細胞凋亡的影響

乳腺癌細胞MCF-7轉染miR-224 ASO后，流式細胞儀檢測細胞凋亡的結果顯示:MCF-7細胞在轉染miR-224 ASO 后，凋亡指數(15.68±1.46)增加明顯，而對照組ASO轉染后凋亡指數(3.36±0.88)無明顯變化(P=0.02)(圖3)。

2.5 降低miR-224的表達對Bcl-2 mRNA和Bcl-2蛋白表達的影響

miR-224 ASO轉染MCF-7細胞后，應用熒光定量PCR和western blot檢查各組細胞中Bcl-2 mRNA和Bcl-2蛋白表達水平，結果發現miR-224 ASO組Bcl-2 mRNA和Bcl-2蛋白的相對表達水平［(1.05 ±0.04)和(0.21±0.03)］明顯低于對照 ASO 轉染組［(4.87±0.96)和(0.88 ±0.09)］，兩者差異有統計學意義(P=0.00，P=0.00(圖4)。

圖2 轉染miR-224 ASO后MCF-7細胞miR-224的表達和生長情況變化

圖3 流式細胞儀檢測miR-224 ASO轉染后的MCF-7細胞凋亡情況

圖4 Bcl-2 mRNA和蛋白在轉染miR-224 ASO的MCF-7細胞中的表達情況

2.6 降低miR-224的表達對活體腫瘤增殖的影響

本實驗所有的裸鼠腫瘤成瘤率為100%，實驗結果發現miR-224ASO穩定轉染組的腫瘤生長速度較對照組明顯減慢，差別有統計學意義(P=0.01)(圖5)。

3 討論

圖5 活體內miR-224ASO轉染的MCF-7細胞所形成腫瘤的體積變化

乳腺癌是危害婦女生命健康的主要疾病，近年來在我國特別是一些大城市和沿海經濟發達地區，其發病率呈迅速上升趨勢，近年來乳腺癌的防治水平取得了較大的進步，其主要歸功于早期發現和診斷的成功及綜合治療的發展。miRNAs是一類新的基因調控因子，在控制細胞的增殖、凋亡等過程中發揮著十分重要的作用。miRNA通過與靶mRNA的3＇非編碼區近乎完全互補結合在轉錄后水平使其降解，或者與之不完全互補結合在翻譯水平抑制蛋白合成，從而在基因表達中發揮重要的調節作用。近年隨著miRNAs研究的不斷深入，發現miRNAs與惡性腫瘤關系密切，一些miRNA可能通過調控細胞的增殖和凋亡直接參與腫瘤形成，另一些可能通過靶定癌基因或抑癌基因而對腫瘤發生進行調控。因此，miRNAs可能成為診斷腫瘤的新的分子標志和判斷腫瘤治療及預后的分子靶點，而且miRNAs在轉錄后水平調節靶基因的表達，這更有助于惡性腫瘤的早期發現、早期診斷和早期治療，也為乳腺癌的早期診治提供了新的希望。

最近研究發現，miR-224在多種惡性腫瘤中表達異常，且與腫瘤的發生、發展密切相關。Shen等［9］檢測了miR-224在宮頸癌組織中的表達顯著高于癌旁正常組織，且與分期、組織學分級、HPV感染、淋巴結轉移等臨床病理特征顯著相關，因此認為，miR-224是一個獨立的宮頸癌的預后指標。另有研究報道，miR-224在結腸癌、非小細胞肺癌等惡性腫瘤中也表達失調，且與腫瘤的臨床分期、病理分級密切相關，提示miR-224與腫瘤細胞的增殖和轉移密切相關［10-11］。關于miR-224表達異常的研究在肝癌中報道較多。Murakami等［12］首次報道 miR-224在肝癌呈過表達;向邦德等［13］發現miR 224的表達與癌組織表達量呈正相關，故血漿miR 224有可能作為1種新的血清學指標用于肝癌診斷。另有報道，在肝癌細胞中miR-224是其中一個最普遍上調miRNA，且miR-224在肝癌細胞中過表達增加肝癌細胞增殖和凋亡、細胞遷移和侵襲［14-15］。MA 等［16］研究結果表明，miR-224 作為致癌基因在肝癌細胞中可能通過PPP2R1B激活AKT信號通路，從而促進肝癌細胞的增殖，遷移和侵襲，因此可能在肝癌發生和發展過程中的扮演著致癌作用。但miR-224在乳腺癌中的表達及其作用機制目前還不清楚。本實驗首先利用實時熒光定量PCR檢測臨床乳腺癌標本和對應的正常癌旁組織，結果發現miR-224在腫瘤組織中相對于對應的正常癌旁組織呈明顯高表達，兩者差異具有統計學意義。為進一步了解miR-224對乳腺癌細胞功能的影響，本實驗首先通過轉染miR-224 ASO降低乳腺癌細胞MCF-7中miR-224的表達，同時利用MTT方法檢測降低miR-224的表達后MCF-7細胞生長情況，結果發現轉染miR-224 ASO的MCF-7細胞存活率較轉染前明顯降低。同時運用克隆形成實驗還發現轉染miR-224 ASO后，MCF-7細胞克隆形成率比對照ASO組明顯減少。同時本實驗在活體內實驗進一步證實穩定轉染miR-224 ASO組MCF-7細胞皮下形成腫瘤的體積減小較對照ASO組顯著減小，兩者差異別有統計學意義。以上實驗結果表明miR-224在乳腺癌細胞的增殖生長中起著重要作用。

此外，本實驗運用流式細胞技術檢測細胞凋亡情況，結果發現轉染miR-224 ASO組細胞凋亡較對照組明顯增加。眾所周知，Bcl-2是細胞凋亡調控基因，為了進一步找出miR-224表達對乳腺癌細胞凋亡情況的調控機制，本實驗通過檢測miR-224 ASO組和對照組Bcl-2的mRNA和蛋白變化，結果發現轉染miR-224 ASO組Bcl-2 mRNA和蛋白水平較對照組明顯降低。這表明miR-224可能通過對Bcl-2表達的調節來調控乳腺癌細胞的凋亡，進而達到對乳腺癌細胞增殖能力的調控。

綜上所述，miR-224不但在乳腺癌發生發展中發揮作用，而且在調控乳腺癌細胞的增殖和凋亡方面也起著重要作用，很可能成為為乳腺癌診治的一個新的癌前標記物和臨床基因治療的新靶點。但其具體的作用機制有待于進一步深入研究。

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