c-kit蛋白表達與小細胞肺癌患者臨床特征及預后的關系

劉暉群 徐國輝 黃 強 齊淑軼 劉敏知 熊林楷 鄒俊韜

小細胞肺癌(SCLC)是肺癌較常見的1種類型，約占所有肺癌的15% ～20%［1］。值得注意的是，SCLC的預后較差，盡管目前化療藥物不斷更新，但是其預后仍未得到顯著改善。在此背景下，SCLC的分子生物學研究有望成為改善患者預后的方法之一。既往研究認為SCLC的發生可能與其表達c-kit基因存在一定的關系［2-3］，本研究旨在探討 SCLC組織表達c-kit蛋白與患者臨床特征及預后的關系，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2011年3月至2014年5月江西省腫瘤醫院收治的159例SCLC患者作為研究對象，男性116例、女性43例，年齡47～72歲，中位年齡57歲。納入標準:①經病理檢查診斷為SCLC;②初次診斷并入院接受治療;③相關檢查均得到完善，臨床資料完整。排除標準:①既往曾接受治療的SCLC患者;②隨訪丟失的患者。

1.2 c-kit蛋白表達檢測方法

步驟如下:①對石蠟切片進行脫蠟至水，方法為二甲苯2次，30 min/次;無水酒精2次，5 min/次;95%酒精2次，5 min/次;80%酒精1次，5 min/次;75%酒精1次，5 min/次;蒸餾水1次，5 min/次。②去除石蠟切片的內源性過氧化物酶:3%H2O2室溫孵育，時間為10～15 min。③沖洗切片:在0.01 M磷酸鹽緩沖液(PBS)中震蕩洗滌玻片，連續3次，3 min/次。④石蠟切片的抗原修復與暴露:在0.01 M檸檬酸緩沖液中浸泡玻片，微波爐加熱修復抗原12 min。室溫冷卻玻片，PBS洗滌，3 min/次，洗滌過程中輕微震蕩片刻。⑤滴加特異性第一抗體，孵育30 min，孵育完畢后用0.01 M PBS洗滌3次，5 min/次，振動清洗。⑥滴加Envision系統(將二抗與酶連接成一個多聚體)，37℃孵育30 min，0.01 M PBS 洗滌 3 次，5 min/次，振動清洗。⑦二氨基聯苯胺(DAB)顯色:在1 ml蒸餾水中滴加DAB顯色試劑A液、B液、C液各1 d，配制DAB顯色劑。顯色3～5 min，蒸餾水終止顯色。⑧蘇木精復染:在陳舊蘇木精溶液浸泡1 min，復染細胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍1～3 min。⑨酒精梯度脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。⑩設立陽性對照與陰性對照，已知陽性的胃腸道間質瘤切片為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 c-kit蛋白表達結果判斷

①細胞著色陽性判斷標準:黃色或者棕黃色顆粒呈彌漫性分布，背景清晰，與陽性對照染色強度一致或者稍弱定義為陽性，未著色定義為陰性。②細胞計數方法:在顯微鏡下進行計數，放大倍數為400倍，選擇10個具有代表性的高倍鏡視野，在免疫組化染色最強區域計數，每個視野計數100個細胞，共計數1 000個腫瘤細胞。③計算標記指數，標記指數=陽性細胞總數/1 000×100%，當標記指數≥50%時定義為c-kit蛋白表達陽性，反之為陰性。

1.4 隨訪方式

所有患者在治療結束后均接受隨訪，隨訪方式主要是門診就診、電話隨訪等，本組患者均得到有效隨訪。

1.5 統計學分析

應用SPSS 19.0統計軟件，計數資料用百分率表示。組間性別、年齡、體質指數、吸煙史、腫瘤大小、腫瘤部位、M分級比較采用四格表χ2檢驗，組間T分級、N分級比較采用秩和檢驗;生存率計算采用Kaplan-Meier法，組間生存率比較采用 Log rank檢驗;P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 觀察組與對照組臨床特征的比較

2組患者性別、年齡、體質指數、吸煙史、腫瘤大小、N分級、M分級方面相比差異無統計學意義(P＞0.05)，觀察組T分級顯著高于對照組，差異有統計學意義，(P ＜0.05)。見表1。

2.2 兩組患者1年生存率的比較

觀察組、對照組 1年生存率分別為 82.4%、91.3%。觀察組1年生存率顯著低于對照組，差異有統計學意義(P ＜0.05)。

表1 觀察組與對照組臨床特征的比較(例，%)

3 討論

肺癌是世界范圍內發病率、死亡率最高的惡性腫瘤，目前已成為全球重要的公共衛生問題之一。根據肺癌的生物學特性，WHO將其分為非小細胞肺癌(NSCLC)、SCLC兩大類，其中NSCLC較為常見。與NSCLC完全不同的是，SCLC腫瘤細胞的倍增時間短、病情進展快，2/3的 SCLC患者在確診時已為廣泛期［4］，因此目前臨床上較少采用手術治療SCLC患者，而化療、放療成為SCLC的主要治療手段。需要引起臨床重視的是，SCLC患者的預后極差，未經治療的SCLC患者中位生存期不足4個月，2年生存率不足1%，即使經過治療，95%的SCLC患者在發病后5年內死亡［5］。盡管目前化療藥物不斷更新，但是SLCL患者的預后仍未得到顯著改善。在上述背景下，各種與惡性腫瘤預后密切相關的分子生物學指標成為SCLC研究的重要課題。

c-kit基因是SCLC研究較多的分子生物學指標之一。值得注意的是，有關SCLC組織表達c-kit蛋白與患者臨床特征、預后的研究，不同研究的結論存在著較大的區別，有時甚至截然相反［2，6-7］，其原因可能包括某些研究的樣本量過少、抽樣誤差過大，c-kit蛋白表達陽性判斷標準不同、個人主觀因素影響等方面。為分析c-kit蛋白與SCLC之間的確切關系，本研究采用了較大的樣本量進行研究，結果顯示SCLC組織表達c-kit蛋白與與患者性別、年齡、體質指數、吸煙史、腫瘤大小、N分級、M分級無相關性，但是與T分級、預后有一定的關系。

分析本研究產生上述結果的原因，得先從c-kit基因的特征入手。c-kit基因定位于人類染色體4q11-12，其編碼產物c-kit蛋白為分子量為145 kD的跨膜糖蛋白。c-kit蛋白屬于受體酪氨酸激酶家族成員，包括細胞外配體結合區、跨膜區、細胞內酪氨酸激酶區等3個區域，其配體為干細胞因子(SCF)。當SCF特異性結合c-kit蛋白以后，后者的酪氨酸激酶活性被激活，進一步通過多種機制啟動Raf-1、Ras、絲裂原活化的蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3激酶等多條信號轉導通路，通過上述通路將細胞外信號轉導至細胞內部，活化細胞質內的轉錄因子，調節基因表達，從而控制細胞的生長、增殖、分化［8-9］。值得注意的是，SCLC細胞的生長、增殖、分化直接影響著患者的T分級，從而進一步影響患者的預后。綜上所述，c-kit蛋白可作為SCLC預后判斷的指標之一，這也預示著酪氨酸激酶抑制劑有可能用于c-kit蛋白表達陽性SCLC患者的治療。

［1］Cadelis G，Kaddah S，Bhakkan B，et al.Epidemiology and incidence of primary lung cancer in a region with low tobacco consumption:Guadeloupe(French West Indies).Data from the cancer registry 2008-2009〔J〕.Rev Mal Respir，2013，30(7):537-548.

［2］Lu HY，Zhang G，Cheng QY，et al.Expression and mutation of the c-kit gene and correlation with prognosis of small cell lung cancer〔J〕.Oncol Lett，2012，4(1):89-93.

［3］Schneider BJ，Kalemkerian GP，Ramnath N，et al.Phase II trial of imatinib maintenance therapy after irinotecan and cisplatin in patients with c-Kit-positive，extensive-stage smallcell lung cancer〔J〕.Clin Lung Cancer，2010，11(4):223-227.

［4］Videtic GM，Stephans KL，Woody NM，et al.Stereotactic body radiation therapy-based treatment model for stage I medically inoperable small cell lung cancer〔J〕.Pract Radiat Oncol，2013，3(4):301-306.

［5］Kudo K，Ohyanagi F，Horiike A，et al.A phase II study of S-1 in relapsed small cell lung cancer〔J〕.Mol Clin Oncol，2013，1(2):263-266.

［6］展峰峰，韓福才.小細胞肺癌c-kit蛋白表達及小細胞肺癌化療后維持治療探討〔J〕.中華臨床醫師雜志(電子版)，2014，8(9):1753-1757.

［7］李 娜，陳公琰.c-kit蛋白在小細胞肺癌組織中的表達及臨床意義〔D〕.哈爾濱醫科大學，2012.

［8］Manaye S，Eritja R，Avi?ó A，et al.Porphyrin binding mechanism is altered by protonation at the loops in G-quadruplex DNA formed near the transcriptional activation site of the human c-kit gene〔J〕.Biochim Biophys Acta，2012，1820(12):1987-1996.

［9］Heger K，Seidler B，Vahl JC，et al.CreER(T2)expression from within the c-Kit gene locus allows efficient inducible gene targeting in and ablation of mast cells〔J〕.Eur J Immunol，2014，44(1):296-306.