自體外周血干細胞移植治療失代償期肝硬化

李梅 黨雙鎖 田長印 翟嵩 賈曉黎 趙文學 張欣 潘國英 王媛 高寧

肝硬化失代償期是多種慢性肝病的終末期狀態，內科治療效果差，病死率較高。目前，最為有效的治療方法是原位肝移植，但因供肝嚴重缺乏、移植后排斥反應、高額的治療費等因素嚴重限制了其臨床應用。近年來隨著干細胞的深入研究，干細胞移植治療肝硬化的動物實驗結果令人滿意，有可能成為除肝移植外治療肝硬化的有效手段。本研究對42例肝硬化失代償期患者進行分組設計，平行對照觀察評價自體外周血干細胞移植治療失代償期肝硬化的有效性及安全性。

資料和方法

一、一般資料

選擇2012年4月至2014年2月于西安交通大學醫學院第二附屬醫院住院治療的42例失代償期肝硬化患者，分為自體干細胞移植組和對照組。干細胞移植組20例，男女比例1.2∶1，年齡39～68歲(平均51.9歲)，其中乙肝肝硬化14例，丙肝肝硬化3例，酒精性肝硬化2例，其他原因所致肝硬化1例，Child-Pugh分級B級18例，C級2例。對照組22例，男女比例1.2∶1，年齡 38 ～70 歲(平均 52.5 歲)，其中乙肝肝硬化14例，丙肝肝硬化3例，酒精性肝硬化2例，自身免疫性肝炎肝硬化2例，其他原因所致肝硬化1例，Child-Pugh分級B級19例，C級3例。兩組患者性別、年齡差異無統計學意義。所有患者住院期間，均予以內科對癥支持治療，包括保肝、利尿、限制水鈉攝入等。治療方案得到醫院倫理委員會同意，且在患者及家屬充分知情的情況下進行，簽署知情同意書。

二、納入標準

臨床診斷均符合2000年《病毒性肝炎防治方案》有關肝硬化的標準［1］。

排除上消化道出血、肝性腦病、原發性肝癌以及妊娠者。

三、自體外周血干細胞移植

(一)外周血干細胞(peripheral blood stem cell，PBSC)采集:予重組人粒細胞集落刺激因子(G-CGF，白特喜，山東科興生物制品有限公司)300μg/d，皮下注射，連續3～4 d，進行PBSC動員。監測外周血白細胞計數及單核細胞計數，當外周血白細胞≥10.0×109/L，單核細胞≥1.0×109/L，滿足采集條件。動員期間觀察有無發熱、骨痛、乏力、皮疹、胃腸道反應、自發性脾破裂、嚴重化膿性感染、高凝狀態等。應用美國Spectra血細胞分離機采集PBSC懸液100 mL。采集過程中觀察患者有無低鈣性口周麻木、抽搐、迷走神經反應性面色蒼白、低血容量性面色蒼白、暈厥等不良反應。分離的PBSC 4℃保存，于4 h內行移植術。

(二)經肝動脈行自體PBSC肝臟移植術:術前6 h行碘過敏試驗、雙側腹股溝備皮。經股動脈穿刺插管，置管于肝固有動脈進行造影，觀察肝內血管情況并排除占位性病變。將干細胞懸液約100 mL經肝動脈緩慢注入;術畢拔管，穿刺點加壓包扎后返回病房，穿刺側下肢制動6 h，臥床24 h。

四、療效觀察

治療后隨訪4、8、12、24周，觀察臨床癥狀變化(乏力、納差、腹脹)，TBil、ALT、AST、Alb、凝血酶原時間(PT)、凝血酶原活動度(PTA)及Child評分。

五、統計學處理

用SPSS 19.0軟件分析。計量資料以 均數±標準差表示，采用t檢驗和方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、術后患者一般情況

干細胞移植組20例患者中17例乏力、納差癥狀減輕，15例腹脹減輕，3例患者自覺癥狀無明顯改善。對照組22例患者中17例乏力、納差、腹脹癥狀減輕，5例無明顯變化。

二、治療后患者肝功能的變化

見表1。治療后8周、12周、24周，干細胞移植組白蛋白較術前及對照組明顯回升。

三、治療后患者凝血功能及Child評分的變化

見表2。術后12周、24周細胞移植組凝血酶原活動度以及術后24周細胞移植組凝血酶原時間較術前明顯改善，但差異無統計學意義。術后12周、24周Child評分較術前及對照組明顯改善，差異有統計學意義。

四、并發癥

干細胞移植組術后出現發熱2例，穿刺部位瘀斑2例，1例于術后第2天出現欣快、行為異常，血氨升高，第4天恢復正常(既往曾出現肝性腦病)，1例術后第3天出現黑便，第4天緩解(既往曾出現上消化道出血)。其余患者術中及術后未出現特殊不適。

五、預后

干細胞移植組20例患者中，2例患者于術后6個月死于肝功能衰竭，1例患者于術后8個月死于上消化道出血。對照組22例患者中，1例死于肝腎綜合征，1例死于肝性腦病，1例死于上消化道出血。

討 論

干細胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化能力的細胞，具有廣泛遷移和特異的定向特性，能優先定位種植于適當的微環境內而增殖分化，目前已用于多種疾病的治療，如造血干細胞移植治療白血病、缺血性心臟病、缺血性下肢血管病等。近年來，骨髓干細胞移植、臍血干細胞移植、間充質干細胞移植等應用于治療慢性肝病的實驗研究及臨床觀察方興未艾，并有成功案例報道。姚鵬等［2］報道自體骨髓干細胞經肝動脈移植治療30例失代償期肝硬化患者，術后12周患者自覺癥狀和肝功能在一定程度上改善。Tetai等［3］報道9例肝硬化患者的自體骨髓干細胞移植治療后，24周血清白蛋白及總蛋白水平均明顯提高。韋玲等［4］通過人臍帶間充質干細胞移植治療1例失代償期肝硬化患者，發現肝功能明顯改善且肝細胞脂肪變性及肝纖維化明顯減輕。

表1 兩組患者治療前后肝功能變化(±s)

注:與術前比較，a P ＜0.05，b P ＜0.01;與細胞移植組比較，c P ＜0.05

組別 例數 TBil(μmol/L) ALT(U/L) AST(U/L) Alb(g/L)干細胞移植組20術前 33.93 ±17.83 49.82 ±39.47 76.36 ±62.68 30.49 ±2.75術后4 周 40.42 ±23.77 41.78 ±18.87 71.78 ±42.12 33.76 ±4.48術后8 周 35.49 ±28.73 36.50 ±26.95 56.80 ±39.98 34.40 ±3.59a術后12 周 32.04 ±17.68 37.00 ±18.78 48.56 ±19.26 37.03 ±3.82b術后24 周 30.54 ±18.84 38.10 ±18.56 58.90 ±35.28 36.18 ±5.42b對照組 22術前 37.74 ±26.10 49.55 ±35.33 63.09 ±38.46 31.52 ±3.32術后4 周 34.43 ±19.16 49.17 ±27.66 71.19 ±35.02 33.41 ±2.34術后8 周 38.63 ±21.99 41.55 ±25.69 70.82 ±46.58 30.19 ±4.04c術后12 周 48.40 ±45.38 37.27 ±30.24 64.55 ±52.93 31.68 ±3.06c術后24 周 63.51 ±50.79 41.82 ±32.23 67.64 ±41.79 33.46 ±3.29c

表2 兩組患者治療前后凝血功能及Child評分變化(±s)

表2 兩組患者治療前后凝血功能及Child評分變化(±s)

注:與術前比較，a P ＜0.05，b P ＜0.01;與對照組比較，c P ＜0.01

Child干細胞移植組組別 例數 PT(S) PTA(%)66 20術前 16.67 ±3.13 52.41 ±14.34 8.10 ±1.07術后4 周 15.34 ±2.55 58.40 ±16.02 7.65 ±0.82術后8 周 15.34 ±2.27 58.07 ±11.74 7.35 ±0.58b術后12 周 14.50 ±1.81 65.99 ±11.22a 6.90 ±0.55bc術后24 周 13.98 ±1.34a 70.08 ±13.27b 6.15 ±0.58bc對照組 22術前 14.77 ±1.74 67.54 ±8.58 8.09 ±1.10術后4 周 13.91 ±1.09 63.04 ±13.92 7.81 ±0.85術后8 周 15.23 ±1.71 61.56 ±12.02 7.78 ±0.86術后12 周 14.36 ±1.64 62.24 ±14.71 7.82 ±0.73術后24 周 14.84 ±2.18 65.62 ±15.68 8.18 ±0.

本研究用自體外周血干細胞移植治療失代償期肝硬化20例，均獲成功，未發現有并發癥或不良事件發生。整個治療主要抓住兩個關鍵:其一是外周血干細胞有效適時的采集，把握粒細胞刺激因子給予的量及選擇采集的時間是干細胞質量的關鍵;其二是干細胞移植，在介入條件下經股動脈插管至肝動脈，注入分離好的外周血干細胞懸液。在臨床實際應用中要取得最佳療效仍然有很多客觀標志物要觀察，如CD34細胞測定就非常重要。

本研究中外周血干細胞移植的失代償期肝硬化患者術后8、12、24周白蛋白較對照組明顯回升;術后12、24周Child評分較術前及對照組明顯改善;凝血酶原活動度及凝血酶原時間較術前有所改善，與國內外學者研究結果基本一致［2，5，6］。分析有效性原因:①與干細胞移植后在肝臟微環境下分化形成成熟肝細胞發揮替代功能有關;②干細胞移植改變肝臟免疫微環境［7］，下調免疫介導的肝損傷;③與干細胞的旁分泌功能有關，可通過分泌多種細胞因子調節肝星狀細胞(HSC)功能。Tanimoto等［8］研究提示，干細胞可通過調節TNFα、TGFβ的水平抑制HSC的活化從而改善肝纖維化。因此移植干細胞將有可能修復損傷的肝硬化組織，促進肝組織結構重建。動物實驗也證實，在干細胞移植肝臟后，不僅可以在肝臟特定的環境下分化為肝系細胞，還可以分泌一些細胞因子，降解纖維化肝組織，參與肝臟的修復［9，10］。

在本研究中干細胞移植患者的安全性也得到進一步證實。Mohamadnejad等［11］對32例自體骨髓干細胞移植的患者進行為期20.5個月的隨訪觀察發現，干細胞移植并未增加肝癌的發生率。因此，自體干細胞移植為大多數終末期肝病患者提供了一種安全、有效、經濟的微創治療方法。尤其在目前白蛋白及凝血酶極為缺乏的現狀下，鼓勵推廣應用就顯得迫切。當然，值得注意的是干細胞移植雖然是微創治療，但對于有明顯的脾功能亢進者、病情相對危重者應慎用或者不用，其臨床的遠期安全性仍有待進一步評估。隨著同行們深入的開展、更多的臨床觀察總結會為更加規范、更加有效的應用干細胞移植手段治療肝硬化失代償期患者提供有效依據。

1 中華醫學會傳染病與寄生蟲病學會和肝病學分會.病毒性肝炎防治方案.中華傳染病雜志，2001，19:56-62.

2 姚鵬，王帥，胡大榮，等.肝動脈自體骨髓干細胞移植治療失代償期肝硬化30例.世界華人消化雜志，2001，13:1639-1640.

3 Terai S，Ishikawa T，Omori K，et al.Improved liver function in patients with liver cirrhosis after autologous bonemarrow cell infusion therapy.Stem Cells，2006，24:2292-2298.

4 韋玲，王莉，李佳，等.干細胞移植治療肝硬化1例.世界華人消化雜志，2012，20:528-530.

5 Gordon MY，Levicar N，Pai M，et al.Characterization and clinical application ofhuman CD34+stem/progenitor cellpopulationsmobilized into the blood by granulocyte colony-stimulating factor.Stem Cells，2006，24:1822-1830.

6 Piscaglia AC，Shupe TD，Oh SH，et al.Granulocyte-colony stimulating factor promotes liver repair and induces oval cellmigration and proliferation in rats.Gastroenterology，2007，133:619-631.

7 崔麗娜，韓英.多能干細胞在肝臟損傷和修復過程中的免疫調節作用.臨床肝膽病雜志，2014，30:855-859.

8 Tanimoto H，Terai S，Taro T，et al.Improvement of liver fibrosis by infusion of cultured cells derived from human bonemarrow.Cell Tissue Res，2013，354:717-728.

9 Lan L，Chen Y，Sun C，et al.Transplantation of bone marrow-derived hepatocyte stem cells transduced with adenovirus-mediated IL-10 gene reverses liver fibrosis in rats.Transpl Int，2008，21:581-592.

10 Dai LJ，Li HY，Guan LX，et al.The therapeutic potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on hepatic cirrhosis.Stem Cell，Res 2009，2:16-25.

11 Mohamadnejad M，Ashrafi M，Alimoghaddam K，et al.Surveillance for hepatocellular carcinoma after autologous stem cell transplantation in cirrhosis.Middle East JDig Dis，2012，4:145-149.

(本文編輯:錢燕)